Interféron alfa 2b recombinant en solution. Les interférons et leur rôle en médecine clinique. Du traitement de la grippe au traitement des infections virales et bactériennes complexes. Médicaments à base d'interféron: indications et contre-indications à leur utilisation

Inclus dans les médicaments

Inclus dans la liste (décret du gouvernement de la Fédération de Russie n° 2782-r du 30 décembre 2014) :

VED

ONLS

ATH :

L.03.A.B.05 Interféron alfa-2b

Pharmacodynamie :

Interféron. C'est un recombinant hautement purifié avec un poids moléculaire de 19 300 daltons. Dérivé d'un clone Escherichia coli par hybridation de plasmides bactériens avec le gène du leucocyte humain codant pour la synthèse de l'interféron. Contrairement à l'interféron, l'alpha-2a est en position 23.

Il a un effet antiviral, qui est dû à l'interaction avec des récepteurs membranaires spécifiques et à l'induction de la synthèse d'ARN et, finalement, des protéines. Ces derniers, à leur tour, empêchent la reproduction normale du virus ou sa libération.

Il a une activité immunomodulatrice, qui est associée à l'activation de la phagocytose, à la stimulation de la formation d'anticorps et de lymphokines.

Il a un effet antiprolifératif sur les cellules tumorales.

Le médicament augmente l'activité phagocytaire des macrophages, potentialise l'effet cytotoxique des lymphocytes.

Pharmacocinétique :

Il pénètre dans la circulation systémique à travers la membrane muqueuse des voies respiratoires, subit une décomposition dans le corps et est partiellement excrété sous forme inchangée, principalement par les reins. L'application topique pour le traitement des infections virales fournit une concentration élevée d'interféron dans le foyer de l'inflammation. Il est métabolisé par le foie, la demi-vie est de 2 à 6 heures.

Les indications:

Hépatite chronique B;

leucémie à tricholeucocytes;

carcinome à cellules rénales ;

Dermique T -lymphome cellulaire (mycosis fongoïde et syndrome de Cesari);

À l'hépatite virale B;

À l'hépatite C virale active;

La leucémie myéloïde chronique;

le sarcome de Kaposi sur fond de SIDA ;

mélanome malin;

- thrombocytose primaire (essentielle) et secondaire;

- forme transitionnelle de la leucémie granulocytaire chronique et de la myélofibrose ;

- myélome multiple;

cancer du rein;

- réticulosarcome;

- sclérose en plaques;

- prévention et traitement de la grippe et des infections virales respiratoires aiguës.

I.B15-B19.B16 Hépatite B aiguë

I.B15-B19.B18.1 Hépatite virale chronique B sans agent delta

I.B15-B19.B18.2 Hépatite virale chronique C

I.B20-B24.B21.0 Maladie à VIH avec manifestations du sarcome de Kaposi

II.C43-C44.C43.9 Mélanome malin de la peau, sans précision

II.C64-C68.C64 Tumeur maligne du rein autre que le bassinet du rein

II.C81-C96.C84 Lymphomes T périphériques et cutanés

II.C81-C96.C84.0 Mycose fongique

II.C81-C96.C84.1 Maladie de Cesari

II.C81-C96.C91.4 Leucémie à tricholeucocytes (réticuloendothéliose leucémique)

II.C81-C96.C92.1 La leucémie myéloïde chronique

Contre-indications :

ré cirrhose non compensée du foie;

psychose;

P hypersensibilité à l'interféron alfa-2 b;

- maladie cardiovasculaire grave;

J Je souhaite la dépression;

MAIS dépendance à l'alcool ou aux drogues;

- maladies auto-immunes;

- infarctus aigu du myocarde;

- troubles graves du système hématopoïétique;

-épilepsie et/ou autres troubles du système nerveux central ;

-hépatite chronique chez les patients recevant ou peu avant de recevoir un traitement immunosuppresseur (à l'exception d'un traitement antérieur de courte durée par des stéroïdes).

Avec attention:

-maladie du foie;

O maladie du rein;

-violation de l'hématopoïèse de la moelle osseuse;

-sensibilité aux maladies auto-immunes;

-sujettes aux tentatives de suicide.

Grossesse et allaitement:

Recommandation FDA catégorie C. Aucune donnée de sécurité disponible. Ne postulez pas ! L'utilisation pendant la grossesse n'est possible que si le bénéfice potentiel pour la mère l'emporte sur le préjudice potentiel pour le bébé.

Pendant l'utilisation du médicament, des méthodes contraceptives doivent être utilisées.

Il n'y a aucune information sur la pénétration dans le lait maternel. Ne pas utiliser pendant l'allaitement.

Dosage et administration:

Entrez par voie intraveineuse ou sous-cutanée. La dose est définie individuellement en fonction du diagnostic et des indicateurs individuels du patient.

Injection sous-cutanée à une dose de 0,5-1 mcg/kg une fois par semaine pendant 6 mois. La dose est choisie en tenant compte de l'efficacité et de la sécurité attendues. Si après 6 mois l'élimination de l'ARN viral du sérum se produit, le traitement est poursuivi jusqu'à un an. Si des effets indésirables surviennent pendant le traitement, la dose est réduite de 2 fois. Si les effets indésirables persistent ou réapparaissent après un changement de dose, le traitement est arrêté. Une réduction de dose est également recommandée lorsque le nombre de neutrophiles est inférieur à 0,75×10 9 /l ou le nombre de plaquettes est inférieur à 50×10 9 /l. Le traitement est arrêté lorsque le nombre de neutrophiles est inférieur à 0,5 × 10 9 /l ou de plaquettes - inférieur à 25 × 10 9 /l. En cas d'insuffisance rénale sévère (clairance inférieure à 50 ml/min), les patients doivent être sous surveillance constante. Si nécessaire, la dose hebdomadaire du médicament est réduite. Il n'est pas nécessaire de modifier la dose en fonction de l'âge.

Préparation de la solution : le contenu pulvérulent du flacon est dissous dans 0,7 ml d'eau pour préparations injectables, le flacon est agité doucement jusqu'à dissolution complète de la poudre. La solution finie doit être inspectée avant administration; en cas de changement de couleur, il ne doit pas être utilisé. Pour l'administration, jusqu'à 0,5 ml de la solution est utilisée, les restes sont éliminés.

Pour le traitement de la grippe et du SRAS- aérosol pour application topique 100 000 ME, administré 7 fois par jour, toutes les 2 heures (dose journalière - jusqu'à 20 000 ME) les deux premiers jours de la maladie, puis 3 fois par jour (dose journalière - jusqu'à 10 000 ME) pendant cinq jours ou jusqu'à ce que les symptômes disparaissent complètement.

La thérapie par interféron est réalisée dans le contexte de la thérapie symptomatique traditionnelle, y compris l'utilisation d'anti-inflammatoires non stéroïdiens (,) avec une augmentation de la température supérieure à 38,5 ° C, des antihistaminiques (diazolin, suprastin, tavegil), des antitussifs (codelac) , mucolytiques (mélange contre la toux,) , ​​agents fortifiants (gluconate de calcium, vitamines).

Effets secondaires:

Du tractus gastro-intestinal : diminution de l'appétit, vomissements, constipation, bouche sèche, douleurs abdominales légères, nausées, diarrhée,violation des sensations gustatives, perte de poids, légères modifications des tests de la fonction hépatique.

Du système nerveux : vertiges, troubles du sommeil, anxiété, agressivité, dépression, neuropathie, tendances suicidaires, détérioration mentale,troubles de la mémoire, nervosité, euphorie, paresthésie, tremblements, somnolence.

Du système circulatoire : hypotension ou hypertension artérielle, troubles du système cardiovasculaire, infarctus du myocarde, thrombocytopénie, tachycardie,arythmie, cardiopathie ischémique, leucopénie, granulocytopénie.

Du système respiratoire : toux, pneumonie, douleurs thoraciques,léger essoufflement, œdème pulmonaire.

Du côté de la peau : alopécie réversible, démangeaisons.

Les autres: anticorps dirigés contre les interférons naturels ou recombinants, raideur musculaire, symptômes pseudo-grippaux.

Surdosage :

Pas de données.

Interaction:

Le médicament inhibe le métabolisme de la théophylline.

Instructions spéciales:

Pendant la période d'utilisation du médicament, il est nécessaire de surveiller l'état mental et neurologique du patient.

Chez les patients atteints de maladies du système cardiovasculaire, une arythmie est possible. Si l'arythmie ne diminue pas ou augmente, la dose doit être réduite de 2 fois ou le traitement doit être arrêté.

En cas d'inhibition sévère de l'hématopoïèse de la moelle osseuse, une étude régulière de la composition du sang périphérique est nécessaire.

Influence sur la capacité à conduire des véhicules et autres appareils techniques

Le médicament sous forme d'aérosol n'affecte pas la capacité de conduire des véhicules et de maintenir les mécanismes en mouvement.

Des instructions

La composition des préparations d'interféron dépend de leur forme de libération.

Formulaire de décharge

Les préparations d'interféron ont les formes de libération suivantes :

• poudre lyophilisée pour la préparation de gouttes ophtalmiques et nasales, solution injectable;
• solution injectable;
• gouttes pour les yeux;
• films oculaires;
• gouttes et vaporisateurs nasaux;
• pommade;
• gel dermatologique;
• liposomes;
• aérosol;
• solution orale;
• suppositoires rectaux;
• suppositoires vaginaux;
• les implants;
• microclysters;
• comprimés (sous forme de comprimés, l'interféron est produit sous le nom de marque Entalferon).

effet pharmacologique

Les préparations d'IFN appartiennent au groupe des médicaments antiviraux et immunomodulateurs.

Tous les IFN ont une activité antivirale et antitumorale. Leur capacité à stimuler l'action est tout aussi importante. macrophages - des cellules qui jouent un rôle important dans l'initiation.

Les IFN contribuent à augmenter la résistance de l'organisme à la pénétration virus et bloquer la reproduction virus lorsqu'ils entrent dans la cellule. Ce dernier est dû à la capacité de l'IFN à supprimer traduction de l'ARN messager (messager) du virus .

En même temps, l'effet antiviral de l'IFN n'est pas dirigé contre certains virus , c'est-à-dire que les IFN ne sont pas caractérisés par une spécificité virale. Ceci explique leur versatilité et une large gamme d'activité antivirale.

Interféron - qu'est-ce que c'est?

Les interférons sont une classe aux propriétés similaires glycoprotéines , qui sont produites par des cellules de vertébrés en réponse à une exposition à divers types d'inducteurs, à la fois viraux et non viraux.

Selon Wikipédia, pour qu'une substance biologiquement active soit qualifiée d'interféron, elle doit être de nature protéique, avoir une activité antivirale en relation avec divers virus , au moins dans des cellules homologues (similaires), "médiées par des processus métaboliques cellulaires, y compris la synthèse d'ARN et de protéines".

La classification des IFN proposée par l'OMS et le Comité Interféron est basée sur des différences dans leurs propriétés antigéniques, physiques, chimiques et biologiques. De plus, il tient compte de leur espèce et de leur origine cellulaire.

Selon l'antigénicité (spécificité antigénique), l'IFN est généralement divisé en acido-résistant et acido-labile. Les interférons alpha et bêta (également appelés IFN de type I) sont acido-résistants. L'interféron gamma (γ-IFN) est acido-labile.

produit α-IFN leucocytes du sang périphérique (leucocytes de type B et T), il était donc auparavant désigné comme interféron leucocytaire . Actuellement, il existe au moins 14 de ses variétés.

Le β-IFN est produit fibroblastes , donc on l'appelle aussi fibroblastique .

Ancienne désignation γ-IFN - interféron immunitaire , mais c'est stimulé Lymphocytes de type T , Cellules NK (normal (natural) killers ; de l'anglais « natural killer ») et (vraisemblablement) macrophages .

Principales propriétés et mécanisme d'action de l'IFN

Sans exception, tous les IFN sont caractérisés par une activité polyfonctionnelle contre les cellules cibles. Leur propriété la plus commune est la capacité d'induire en eux état antiviral .

L'interféron est utilisé comme agent thérapeutique et prophylactique pour divers infections virales . Une caractéristique des préparations d'IFN est que leur effet s'affaiblit avec des injections répétées.

Le mécanisme d'action de l'IFN est lié à sa capacité à inhiber infections virales . À la suite d'un traitement avec des médicaments à base d'interféron dans le corps du patient autour foyer d'infection une sorte de barrière est formée de résistant à virus cellules non infectées, ce qui empêche la propagation de l'infection.

Interagissant avec des cellules encore intactes (intactes), il empêche la mise en place du cycle de reproduction virus en activant certaines enzymes cellulaires ( protéines kinases ).

La fonction la plus importante des interférons est la capacité de supprimer hématopoïèse ; moduler la réponse immunitaire et la réponse inflammatoire du corps; réguler les processus de prolifération et de différenciation cellulaires ; inhiber la croissance et empêcher la reproduction cellules virales ; stimuler l'expression de la surface antigènes ; supprimer des fonctions individuelles Leucocytes de type B et T stimuler l'activité Cellules NK etc..

Utilisation de l'IFN en biotechnologie

Développement de méthodes de synthèse et de purification haute performance leucocytes et interférons recombinants en quantités suffisantes pour la production de médicaments, a permis d'ouvrir la possibilité d'utiliser des préparations d'IFN pour le traitement de patients diagnostiqués avec hépatite virale .

Une caractéristique distinctive des IFN recombinants est qu'ils sont produits en dehors du corps humain.

Par exemple, interféron bêta-1a recombinant (IFN β-1a) obtenu à partir de cellules de mammifères (en particulier, à partir de cellules d'ovaire de hamster chinois), et similaire dans ses propriétés interféron bêta-1b (IFN β-1b) produit par un membre de la famille des Enterobacteriaceae coli (Escherichia coli).

Médicaments inducteurs d'interféron - qu'est-ce que c'est?

Les inducteurs d'IFN sont des médicaments qui ne contiennent pas eux-mêmes d'interféron, mais qui stimulent en même temps sa production.

Pharmacodynamique et pharmacocinétique

Le principal effet biologique de l'α-IFN est inhibition de la synthèse des protéines virales . L'état antiviral de la cellule se développe en quelques heures après l'application du médicament ou l'induction de la production d'IFN dans le corps.

Dans le même temps, l'IFN n'affecte pas les premiers stades cycle de réplication, c'est-à-dire au stade de l'adsorption, de la pénétration virus dans la cellule (pénétration) et libération du composant interne virus en train de le déshabiller.

Action antivirus L'α-IFN se manifeste même en cas d'infection cellulaire ARN infectieux . L'IFN ne pénètre pas dans la cellule, mais interagit uniquement avec des récepteurs spécifiques sur membranes cellulaires (gangliosides ou structures similaires contenant oligosucre ).

Le mécanisme d'activité de l'IFN alpha ressemble à l'action de l'individu hormones glycopeptidiques . Il stimule l'activité gènes , dont certains interviennent dans le codage de la formation de produits à action antivirale .

interférons β ont aussi action antivirale , qui est associé à plusieurs mécanismes d'action à la fois. Interféron bêta active la NO-synthétase, qui à son tour augmente la concentration d'oxyde nitrique à l'intérieur de la cellule. Ce dernier joue un rôle clé dans la suppression de la reproduction virus .

Le β-IFN active les fonctions effectrices secondaires tueurs naturelsdans , Lymphocytes de type B , monocytes sanguins , macrophages tissulaires (phagocytes mononucléaires) et neutrophile , qui se caractérisent par une cytotoxicité dépendante et indépendante des anticorps.

De plus, le β-IFN bloque la libération du composant interne virus et perturbe les processus de méthylation ARN viral .

γ-IFN est impliqué dans la régulation de la réponse immunitaire et régule la sévérité réactions inflammatoires. Bien qu'il ait le sien antiviral et effet antitumoral , interféron gamma très faible. Dans le même temps, il améliore considérablement l'activité des α- et β-IFN.

Après administration parentérale, la concentration maximale d'IFN est observée après 3 à 12 heures.L'indice de biodisponibilité est de 100% (à la fois après injection sous la peau et après injection dans le muscle).

La durée de la demi-vie T½ est de 2 à 7 heures. Des traces de concentration d'IFN dans le plasma ne sont pas détectées après 16 à 24 heures.

Indications pour l'utilisation

L'IFN est conçu pour traiter maladies virales qui a frappé voies respiratoires .

De plus, des préparations d'interféron sont prescrites aux patients atteints de formes chroniques hépatite et Delta .

Pour traitement maladies virales et, en particulier, l'IFN-α est principalement utilisé (les deux étant l'IFN-alpha 2b et l'IFN-alpha 2a). Le "gold standard" du traitement hépatite C considérés comme des interférons pégylés alpha-2b et alpha-2a. En comparaison avec eux, les interférons conventionnels sont moins efficaces.

Le polymorphisme génétique noté dans le gène IL28B, responsable du codage de l'IFN lambda-3, entraîne des différences significatives dans l'effet du traitement.

Patients de génotype 1 hépatite C avec des allèles communs de ce gène sont plus susceptibles d'obtenir des résultats de traitement plus longs et plus prononcés par rapport aux autres patients.

L'IFN est aussi souvent administré aux patients maladies oncologiques : malin , tumeurs endocrines pancréatiques , lymphome non hodgkinien , tumeurs carcinoïdes ; le sarcome de Kaposi , à cause de ; leucémie à tricholeucocytes ,myélome multiple , cancer du rein etc..

Contre-indications

L'interféron n'est pas prescrit aux patients présentant une hypersensibilité à celui-ci, ainsi qu'aux enfants et adolescents souffrant de troubles mentaux graves et troubles du système nerveux , qui s'accompagnent d'idées suicidaires et de tentatives de suicide, graves et prolongées.

En combinaison avec médicament antiviral ribavirine L'IFN est contre-indiqué chez les patients diagnostiqués avec une déficience grave un rein (conditions dans lesquelles CC est inférieur à 50 ml/min).

Les préparations d'interféron sont contre-indiquées en cas de (dans les cas où le traitement approprié ne donne pas l'effet clinique attendu).

Effets secondaires

L'interféron appartient à la catégorie des médicaments pouvant provoquer un grand nombre d'effets indésirables provenant de divers systèmes et organes. Dans la plupart des cas, ils résultent de l'introduction d'interféron in/in, s/c ou/m, mais d'autres formes pharmaceutiques du médicament peuvent également les provoquer.

Les effets indésirables les plus courants liés à la prise d'IFN sont :

• anorexie;
• nausée;
• des frissons;
• tremblement dans le corps.

Vomissements, augmentation, sensation de bouche sèche, perte de cheveux (), asthénie ; symptômes non spécifiques ressemblant symptômes de la grippe ; mal au dos, états dépressifs , douleurs musculo-squelettiques , pensées suicidaires et tentative de suicide, malaise général, troubles du goût et de la concentration, irritabilité accrue, troubles du sommeil (souvent), hypotension artérielle , confusion.

Les effets indésirables rares incluent : douleur à droite dans la partie supérieure de l'abdomen, éruptions cutanées sur le corps (érythémateuses et maculopapuleuses), nervosité accrue, douleur et inflammation sévère au site d'injection, infection virale secondaire (y compris les infections virus herpes simplex ), sécheresse accrue de la peau, , douleur dans les yeux , conjonctivite vision floue, dysfonctionnement glandes lacrymales , anxiété, labilité de l'humeur ; troubles psychotiques , y compris une agressivité accrue, etc. ; hyperthermie , symptômes dyspeptiques , troubles respiratoires, perte de poids, selles molles, hyper ou hypothyroïdie , déficience auditive (jusqu'à sa perte complète), formation d'infiltrats dans les poumons, augmentation de l'appétit, saignement des gencives, dans les membres, dyspnée , dysfonctionnement rénal et développement d'une insuffisance rénale , ischémie périphérique , hyperuricémie , neuropathie etc..

Le traitement avec des médicaments IFN peut causer dysfonctionnement reproductif . Des études chez les primates ont montré que l'interféron perturbe le cycle menstruel chez les femmes . De plus, chez les femmes traitées par IFN-α, le niveau de et in.

Pour cette raison, lors de la prescription d'interféron, les femmes en âge de procréer doivent utiliser contraceptifs barrières . Il est également conseillé aux hommes en âge de procréer d'être informés des effets secondaires potentiels.

Dans de rares cas, le traitement par interféron peut s'accompagner de troubles ophtalmiques, qui se traduisent par hémorragies dans la rétine , rétinopathie (y compris, mais sans s'y limiter œdème maculaire ), modifications focales de la rétine, diminution de l'acuité visuelle et/ou champs visuels limités, œdème papillaire , névrite du nerf ophtalmique (deuxième crânien) , obstruction artérielle ou veines rétiniennes .

Parfois, dans le contexte de la prise d'interféron peut se développer hyperglycémie , symptômes du syndrome néphrotique , . Chez les patients avec Diabète peut aggraver le tableau clinique de la maladie.

Il ne peut être exclu que la possibilité de hémorragie cérébrovasculaire , érythème polymorphe , nécrose tissulaire au point d'injection ischémie cardiaque et cérébrovasculaire , hypertriglycéridémie , sarcoïdose (ou exacerbation de son cours), Les syndromes de Lyell et Stevens-Johnson .

L'utilisation d'interféron seul ou en association avec Ribavirine dans de rares cas, il peut provoquer anémie aplastique (AA) ou encore PAKKM ( aplasie complète de la moelle osseuse rouge ).

Il y a également eu des cas où, dans le contexte d'un traitement avec des préparations d'interféron, le patient a développé diverses auto-immune et troubles à médiation immunitaire (y compris la maladie de Werlhof et La maladie de Moszkowitz ).

Interféron, mode d'emploi (Méthode et posologie)

Les instructions d'utilisation des interférons alpha, bêta et gamma indiquent qu'avant de prescrire un médicament à un patient, il est recommandé de déterminer sa sensibilité qui a causé la maladie.

Le mode d'administration de l'interféron leucocytaire humain est déterminé en fonction du diagnostic posé au patient. Dans la plupart des cas, il est prescrit sous forme d'injections sous-cutanées, mais dans certains cas, le médicament peut être injecté dans un muscle ou une veine.

La dose de traitement, la dose d'entretien et la durée du traitement sont déterminées en fonction de la situation clinique et de la réponse de l'organisme du patient à la thérapie qui lui est prescrite.

Par interféron "pour enfants", on entend un médicament sous forme de suppositoires, de gouttes et de pommades.

Les instructions d'utilisation de l'interféron pour les enfants recommandent l'utilisation de ce médicament en tant qu'agent thérapeutique et prophylactique. La dose pour les nourrissons et les enfants plus âgés est choisie par le médecin traitant.

À des fins prophylactiques, l'INF est utilisé sous la forme d'une solution pour la préparation de laquelle de l'eau distillée ou bouillie à température ambiante est utilisée. La solution finie est colorée en rouge et opalescente. Il doit être conservé au froid pendant 24 à 48 heures maximum. Le médicament est instillé dans le nez des enfants et des adultes.

À maladies ophtalmiques virales le médicament est prescrit sous forme de gouttes pour les yeux.

Dès que la gravité des symptômes de la maladie diminue, le volume des instillations doit être réduit à une goutte. La durée du traitement est de 7 à 10 jours.

Pour le traitement des lésions causées par virus de l'herpès , la pommade est appliquée avec une fine couche sur les zones touchées de la peau et des muqueuses deux fois par jour, en maintenant des intervalles de 12 heures. La durée du traitement est de 3 à 5 jours (jusqu'à ce que l'intégrité de la peau et des muqueuses endommagées soit complètement restaurée).

Pour la prévention ORZ et doit être lubrifié les voies nasales . La fréquence des procédures au cours de la 1ère et de la 3ème semaine de cours est de 2 fois par jour. Au cours de la 2e semaine, il est recommandé de faire une pause. À des fins prophylactiques, l'interféron doit être utilisé pendant toute la période épidémies de maladies respiratoires .

La durée du parcours de rééducation chez les enfants qui ont souvent infections virales et bactériennes récurrentes des voies respiratoires , Organes ORL , infection récurrente causé par virus herpes simplex , est de deux mois.

Comment se reproduire et comment utiliser l'interféron en ampoules?

Les instructions d'utilisation de l'interféron en ampoules indiquent qu'avant utilisation, l'ampoule doit être ouverte, versée dedans avec de l'eau (distillée ou bouillie) à température ambiante jusqu'à la marque sur l'ampoule correspondant à 2 ml.

Le contenu est doucement agité jusqu'à dissolution complète. La solution est injectée dans chaque Passage nasal deux fois par jour, cinq gouttes, en maintenant des intervalles d'au moins six heures entre les injections.

A des fins thérapeutiques, l'IFN est démarré dès la première symptômes de la grippe . L'efficacité du médicament est d'autant plus élevée que le patient commence à le prendre tôt.

La plus efficace est la méthode d'inhalation (par le nez ou la bouche). Pour une inhalation, il est recommandé de prendre le contenu de trois ampoules du médicament, dissous dans 10 ml d'eau.

L'eau est préchauffée à une température ne dépassant pas +37 °C. Les procédures d'inhalation sont effectuées deux fois par jour, en maintenant un intervalle d'au moins une à deux heures entre elles.

Lors de la pulvérisation ou de l'instillation, le contenu de l'ampoule est dissous dans deux millilitres d'eau et injecté 0,25 ml (ou cinq gouttes) dans chaque passage nasal trois à six fois par jour. La durée du traitement est de 2-3 jours.

À des fins préventives, les gouttes nasales pour les enfants sont instillées (5 gouttes) deux fois par jour, au stade initial du développement de la maladie, la fréquence des instillations est augmentée: le médicament doit être administré au moins cinq à six fois par jour tous les heure ou deux.

Beaucoup se demandent s'il est possible de faire couler une solution d'interféron dans les yeux. La réponse à cette question est affirmative.

Surdosage

Les cas de surdosage avec l'interféron ne sont pas décrits.

Interaction

Le β-IFN est compatible avec corticostéroïdes et ACTH. Ne doit pas être pris pendant le traitement médicaments myélosuppresseurs , incl. cytostatiques (cela peut causer effet additif ).

Avec prudence, l'IFN-β est prescrit avec des agents dont la clairance dépend largement de systèmes de cytochrome P450 (médicaments antiépileptiques , quelques antidépresseurs et etc.).

Ne prenez pas d'IFN-alpha et Telbivudine . L'utilisation simultanée d'α-IFN provoque une amélioration mutuelle de l'action par rapport à. Lorsqu'il est utilisé avec phosphazide peuvent augmenter mutuellement myélotoxicité les deux médicaments (il est recommandé de surveiller attentivement les modifications de la quantité granulocytes et;

à état septique ;

pour le traitement des enfants infections virales (par exemple, ou );

pour traitement hépatite virale chronique .

L'IFN est également utilisé en thérapie, dont le but est la réhabilitation de patients fréquemment malades. infections respiratoires enfants.

L'option la plus optimale pour prendre les enfants est les gouttes nasales: l'interféron ne pénètre pas dans le tractus gastro-intestinal avec cette utilisation (avant de diluer le médicament pour le nez, l'eau doit être chauffée à une température de 37 ° C).

Pour les nourrissons, l'interféron est prescrit sous forme de suppositoires (150 000 UI). Les bougies pour enfants doivent être administrées une à la fois, 2 fois par jour, en maintenant des intervalles de 12 heures entre les injections. La durée du traitement est de 5 jours. Guérir complètement un enfant SRAS En règle générale, un cours suffit.

Pour le traitement, prendre 0,5 g de pommade deux fois par jour. Le traitement dure en moyenne 2 semaines. Au cours des 2 à 4 semaines suivantes, la pommade est appliquée 3 fois par semaine.

De nombreuses critiques positives sur le médicament indiquent que, sous cette forme posologique, il s'est également imposé comme un traitement efficace pour stomatite et amygdales enflammées . Les inhalations avec interféron pour les enfants ne sont pas moins efficaces.

L'effet de l'utilisation du médicament augmente considérablement si un nébuliseur est utilisé pour son administration (il est nécessaire d'utiliser un appareil qui pulvérise des particules d'un diamètre supérieur à 5 microns). Les inhalations à travers un nébuliseur ont leurs propres spécificités.

Premièrement, l'interféron doit être inhalé par le nez. Deuxièmement, avant d'utiliser l'appareil, il est nécessaire de désactiver la fonction de chauffage (l'IFN est une protéine, il est détruit à une température supérieure à 37 ° C).

Pour l'inhalation dans un nébuliseur, le contenu d'une ampoule est dilué dans 2-3 ml d'eau distillée ou minérale (vous pouvez également utiliser une solution saline à cet effet). Le volume résultant est suffisant pour une procédure. La fréquence des procédures au cours de la journée est de 2 à 4.

Il est important de se rappeler que le traitement à long terme des enfants par l'interféron n'est pas recommandé, car la dépendance s'y développe et, par conséquent, l'effet attendu ne se développe pas.

Interféron pendant la grossesse

Une exception peut être les cas où le bénéfice attendu du traitement pour la future mère l'emportera sur le risque de réactions indésirables et d'effets indésirables sur le développement du fœtus.

La possibilité d'isoler les composants de l'IFN recombinant avec du lait maternel n'est pas exclue. Étant donné que la possibilité d'exposition du fœtus par le lait ne peut être exclue, l'IFN n'est pas prescrit aux femmes qui allaitent.

Dans les cas extrêmes, lorsqu'il est impossible d'éviter la nomination d'IFN, il est recommandé à la femme de refuser d'allaiter pendant le traitement. Pour atténuer l'effet secondaire du médicament (l'apparition de symptômes similaires à ceux de la grippe), il est recommandé de co-administrer avec l'IFN .

substance-solution : packs Rég. N° : LSR-007009/08

Groupe clinico-pharmacologique :

Forme de démoulage, composition et conditionnement

substance -la solution.

bouteilles (1) - emballages en carton.

Description des ingrédients actifs du médicament Interféron alfa-2b»

effet pharmacologique

Interféron. Il s'agit d'une protéine recombinante hautement purifiée d'un poids moléculaire de 19 300 daltons. Obtenu à partir d'un clone d'Escherichia coli par hybridation de plasmides bactériens avec le gène de leucocytes humains codant pour la synthèse de l'interféron. Contrairement à l'interféron, l'alpha-2a a l'arginine en position 23.

Il a un effet antiviral, qui est dû à l'interaction avec des récepteurs membranaires spécifiques et à l'induction de la synthèse d'ARN et, finalement, des protéines. Ces derniers, à leur tour, empêchent la reproduction normale du virus ou sa libération.

Il a une activité immunomodulatrice, qui est associée à l'activation de la phagocytose, à la stimulation de la formation d'anticorps et de lymphokines.

Il a un effet antiprolifératif sur les cellules tumorales.

Les indications

Hépatite B aiguë, hépatite B chronique, hépatite C chronique.

Leucémie à tricholeucocytes, leucémie myéloïde chronique, carcinome à cellules rénales, sarcome de Kaposi sur fond de SIDA, lymphome cutané à cellules T (mycosis fongoïde et syndrome de Cesari), mélanome malin.

Schéma posologique

Entrez in / in ou s / c. La dose et le schéma thérapeutique sont définis individuellement, en fonction des indications.

Effet secondaire

Symptômes pseudo-grippaux: souvent - fièvre, frissons, douleurs dans les os, les articulations, les yeux, myalgie, maux de tête, transpiration accrue, étourdissements.

Du système digestif : diminution possible de l'appétit, nausées, vomissements, diarrhée, constipation, troubles du goût, bouche sèche, perte de poids, douleurs abdominales légères, légères modifications des tests de la fonction hépatique (généralement normaux après la fin du traitement).

Du côté du système nerveux central et du système nerveux périphérique : rarement - étourdissements, détérioration mentale, troubles du sommeil, troubles de la mémoire, anxiété, nervosité, agressivité, euphorie, dépression (après un traitement prolongé), paresthésie, neuropathie, tremblements ; dans certains cas - tendance au suicide, somnolence.

Du côté du système cardiovasculaire : possible - tachycardie (avec fièvre), hypotension ou hypertension artérielle, arythmie ; dans certains cas - violations du système cardiovasculaire, maladie coronarienne, infarctus du myocarde.

Du système respiratoire : rarement - douleur thoracique, toux, léger essoufflement; dans certains cas - pneumonie, œdème pulmonaire.

Du système hématopoïétique : possible légère leucopénie, thrombocytopénie, granulocytopénie.

Réactions dermatologiques : démangeaisons possibles, alopécie réversible.

Les autres: rarement - raideur musculaire; dans des cas isolés - anticorps anti-interférons naturels ou recombinants.

Contre-indications

Maladie cardiovasculaire sévère, cirrhose décompensée du foie, dépression sévère, psychose, dépendance à l'alcool ou aux drogues, hypersensibilité à l'interféron alfa-2b.

Grossesse et allaitement

L'utilisation pendant la grossesse n'est possible que si le bénéfice attendu du traitement pour la mère l'emporte sur le risque potentiel pour le fœtus.

On ne sait pas si l'interféron alfa-2b est excrété dans le lait maternel. Si nécessaire, l'utilisation pendant l'allaitement doit décider de l'arrêt de l'allaitement.

Les femmes en âge de procréer doivent utiliser une contraception fiable pendant le traitement.

Application pour violation de la fonction hépatique

Contre-indiqué dans la cirrhose décompensée du foie. Utiliser avec prudence chez les patients présentant une insuffisance hépatique.

Application pour violation de la fonction rénale

Utiliser avec prudence chez les patients présentant une insuffisance rénale.

instructions spéciales

Utiliser avec prudence chez les patients présentant une insuffisance rénale, hépatique, de l'hématopoïèse de la moelle osseuse, avec une tendance aux tentatives de suicide.

Chez les patients atteints de maladies du système cardiovasculaire, une arythmie est possible. Si l'arythmie ne diminue pas ou augmente, la dose doit être réduite de 2 fois ou le traitement doit être arrêté.

Pendant la période de traitement, il est nécessaire de contrôler l'état neurologique et mental.

En cas d'inhibition sévère de l'hématopoïèse de la moelle osseuse, une étude régulière de la composition du sang périphérique est nécessaire.

L'interféron alfa-2b a un effet stimulant sur le système immunitaire et doit donc être utilisé avec prudence chez les patients sujets aux maladies auto-immunes en raison d'un risque accru de réactions auto-immunes.

interaction médicamenteuse

interaction médicamenteuse

L'interféron alfa-2b inhibe le métabolisme de la théophylline et réduit sa clairance.

L'invention concerne le génie génétique, la biotechnologie, la médecine, la pharmacologie. Un nouvel ADN plasmidique multicopie recombinant pSX50 codant pour la synthèse de l'interféron leucocytaire humain alpha-2b, dont l'expression est sous le contrôle de promoteurs lactose et tryptophane et d'un terminateur de transcription. À la suite de la transformation des cellules de la souche réceptrice E. coli BL21 avec l'ADN plasmidique recombinant pSX50, la souche E. coli SX50 a été obtenue - un producteur d'interféron leucocytaire humain recombinant alpha-2b avec une productivité allant jusqu'à 0,9-1,0 g d'interféron alpha-2b pour 1 litre de milieu de culture. La méthode d'obtention de l'interféron alpha-2b recombinant est basée sur l'utilisation de la souche recombinante créée E. coli SX50 et implique sa culture profonde sur un milieu nutritif à teneur réduite en tryptophane avec l'ajout continu de substrats nutritifs au cours de la biosynthèse, la destruction mécanique de cellules de micro-organismes à haute pression, dissolution de la protéine agrégée dans une solution concentrée de chlorhydrate de guanidine suivie d'une renaturation de l'interféron dans des solutions tampons physiologiques en présence d'agents chaotropes et sa purification à l'aide d'une purification chromatographique en trois étapes de l'interféron sur des résines telles que Chelating Sepharose Fast Flow immobilisé avec des ions Cu +2, chromatographie d'échange d'ions sur des résines échangeuses d'ions telles que SM Sephsrose Fast Flow et chromatographie de filtration sur gel sur des résines de type Superdex 75. yah lors de la coloration des gels avec de l'argent et plus de 98% selon RF HPLC et apyrogène (test LAL) en quantités d'au moins 400-800 mg par 1 litre de milieu de culture. 3 n. et 3 z.p f-ly, 6 mauvais.

Dessins au brevet RF 2242516

L'invention concerne des médicaments génétiquement modifiés obtenus par des moyens biotechnologiques, à savoir des procédés de production industrielle d'interféron alpha-2b leucocytaire humain recombinant à des fins médicales (ci-après dénommé interféron), ainsi que des souches recombinantes produisant Escherichia coli (E. coli) et l'ADN plasmidique, codant pour la synthèse de l'interféron.

Les interférons sont des molécules protéiques d'un poids moléculaire de 15 000 à 21 000 daltons produites et sécrétées par les cellules en réponse à une infection virale ou à d'autres agents pathogènes. Il existe trois principaux groupes d'interférons : alpha, bêta et gamma. En eux-mêmes, ces groupes ne sont pas homogènes et peuvent contenir plusieurs variétés moléculaires différentes d'interféron. Ainsi, plus de 14 variétés génétiques d'interféron alpha ont été identifiées, qui présentent un intérêt et sont largement utilisées en médecine comme agents antiviraux, antiprolifératifs et immunomodulateurs.

Procédés connus de production d'interféron leucocytaire humain à partir de leucocytes humains induits par des virus et d'autres inducteurs (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).

Le principal inconvénient de ces méthodes de production d'interférons est la probabilité de contamination du produit final par des virus humains, tels que les virus de l'hépatite B et C, le virus de l'immunodéficience, etc.

A l'heure actuelle, la méthode d'obtention d'interféron par synthèse microbiologique est reconnue comme plus prometteuse, ce qui permet d'obtenir le produit cible avec un rendement beaucoup plus élevé à partir d'une matière première relativement peu coûteuse. Les approches utilisées dans ce cas permettent de créer des variants du gène de structure optimaux pour l'expression bactérienne, ainsi que des éléments régulateurs qui contrôlent son expression.

Divers modèles de souches de Pichia pastoris, Pseudomonas putida et Escherichia coli sont utilisés comme micro-organismes initiaux.

L'inconvénient d'utiliser P. pastoris comme producteur d'interféron (J.N. Garcia, J.A. Aguiar et. al. //High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris.//Biotecnologia Aplicada, 12(3),152-155, 1995 ), est des conditions extrêmement difficiles pour la fermentation de ce type de levure, la nécessité de maintenir strictement la concentration de l'inducteur, en particulier du méthanol, dans le processus de biosynthèse. L'inconvénient d'utiliser des souches de Ps. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) est la complexité du processus de fermentation à faible niveau d'expression (10 mg d'interféron pour 1 litre de milieu de culture). Plus productive est l'utilisation de souches d'Escherichia coli (Semin. Oncol., 1997, juin ; 24 (3 Suppl. 9) : S9-41-S9-51).

Un grand nombre de plasmides et de souches d'E. coli exprimant l'interféron sont connus : souches d'E. coli ATCC 31633 et 31644 avec les plasmides Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 ou Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35 - AHL6 (SU 1764515), souche E. coli pINF-AP2 (SU 1312961), souche E. coli pINF-F-Pa (AU 1312962), souche E. coli SG 20050 avec plasmide p280/21FN (Kravchenko V.V. et al. Bioorganic chemistry, 1987, v. 13, No. 9, p. 1186-1193), la souche E. coli SG 20050 avec le plasmide pINF14 (SU 1703691), la souche E. coli SG 20050 avec le plasmide pINF16 (RU 2054041) et etc. L'inconvénient des technologies basées sur l'utilisation de ces souches est leur instabilité, ainsi qu'un niveau insuffisant d'expression de l'interféron.

Outre les caractéristiques des souches utilisées, l'efficacité du procédé dépend largement de la technologie utilisée pour l'isolement et la purification de l'interféron.

Un procédé connu de production d'interféron, qui comprend la culture de cellules Ps. putida, destruction de la biomasse, traitement polyéthylèneimine, fractionnement au sulfate d'ammonium, chromatographie hydrophobe sur phénylsilochrome C-80, fractionnement pH du lysat, sa concentration et diafiltration, chromatographie échangeuse d'ions sur cellulose DE-52, élution à gradient de pH, chromatographie échangeuse d'ions du éluant obtenu sur cellulose CM-52, concentration par passage sur cassette filtrante et filtration sur gel de Sephadex G-100 (SU 1640996). L'inconvénient de cette méthode, en plus de la fermentation complexe en plusieurs étapes, est le processus en plusieurs étapes pour obtenir le produit final.

On connaît également un procédé de production d'interféron, qui consiste à cultiver la souche E. coli SG 20050/pIF16 dans du bouillon LB dans des flacons dans un agitateur thermostaté, à centrifuger la biomasse, à la laver avec une solution tampon et à sonifier pour détruire les cellules. Le lysat résultant est centrifugé, lavé avec de l'urée 3 M dans un tampon, dissous dans du chlorure de guanidine dans un tampon, soniqué, centrifugé, sulfitolyse oxydative, dialyse contre de l'urée 8 M, renaturation et chromatographie finale en deux étapes sur cellulose CM-52 et Sephadex G -50 (RU 2054041). Les inconvénients de cette méthode sont sa productivité relativement faible des principales étapes du procédé d'isolement et de purification. C'est notamment le cas du traitement ultrasonique du produit, de la dialyse et de la sulfitolyse oxydative, qui entraîne une instabilité du rendement en interféron, ainsi que l'impossibilité d'utiliser ce procédé pour la production industrielle d'interféron.

Comme analogue le plus proche (prototype), on peut indiquer une méthode d'obtention d'interféron leucocytaire humain, qui consiste à cultiver une souche recombinante d'E. coli, à congeler la biomasse résultante à une température ne dépassant pas -70 ° C, à décongeler, à détruire les cellules de micro-organismes lysozyme, élimination de l'ADN et de l'ARN par introduction dans le lysat de DNase et purification de la forme insoluble isolée d'interféron par lavage avec une solution tampon avec des détergents, dissolution du précipité d'interféron dans une solution de chlorhydrate de guanidine, renaturation et purification en une étape par ion - chromatographie d'échange. En tant que producteur, une souche E. coli SS5 obtenue à l'aide d'un plasmide pSS5 recombinant contenant trois promoteurs : Plac, Pt7 et Ptrp, et un gène d'interféron alpha avec des substitutions de nucléotides introduites est utilisée.

L'expression de l'interféron par la souche E. coli SS5 contenant ce plasmide est contrôlée par trois promoteurs : P lac , P t7 et P trp . Le niveau d'expression de l'interféron est d'environ 800 mg pour 1 litre de suspension cellulaire (RU 2165455).

L'inconvénient de cette méthode est la faible fabricabilité de l'utilisation de la destruction enzymatique des cellules, de l'ADN et de l'ARN du micro-organisme et de la purification chromatographique en une étape de l'interféron. Cela provoque une instabilité du processus d'isolement de l'interféron, conduit à une diminution de sa qualité et limite la possibilité d'utiliser le schéma ci-dessus pour la production industrielle d'interféron. Les inconvénients de ce plasmide et de la souche basée sur celui-ci sont l'utilisation dans le plasmide d'un promoteur de phage T7 non régulé fort dans la souche E. coli BL21 (DE3), dans lequel le gène de l'ARN polymérase T7 est sous le promoteur de l'opéron lac et qui toujours "flux". Par conséquent, la synthèse d'interféron se produit en continu dans la cellule, ce qui entraîne une dissociation du plasmide et une diminution de la viabilité des cellules de la souche, et par conséquent une diminution du rendement en interféron.

L'objectif de la présente invention est de construire une souche industrielle recombinante d'E. coli productrice utilisant un nouvel ADN plasmidique recombinant à haut niveau de biosynthèse d'interféron, et de développer une technologie industrielle efficace pour l'obtention d'une substance interféron à usage médical, correspondant en qualité à la "Pharmacopée européenne" pour la substance interféron alfa-2b.

Ce problème a été résolu en créant de l'ADN plasmidique recombinant pSX50 et la souche Escherichia coli SX50, déposée dans la collection panrusse de souches industrielles de l'entreprise unitaire de l'État fédéral GosNII Genetics, numéro VKPM V-8550,

ainsi qu'un procédé d'obtention d'interféron alpha-2b recombinant basé sur l'utilisation d'une souche E. coli SX50 recombinante et impliquant sa culture en profondeur sur un milieu nutritif à teneur réduite en tryptophane avec ajout continu de substrats nutritifs lors de la biosynthèse, destruction mécanique des cellules de micro-organismes à haute pression, dissolution des protéines agrégées dans une solution concentrée de chlorhydrate de guanidine suivie d'une renaturation de l'interféron dans des solutions tampons physiologiques en présence d'agents chaotropes et purification chromatographique en trois étapes de l'interféron sur des résines telles que Chelating Sepharose Fast Flow, immobilisé avec des ions Cu +2, chromatographie d'échange d'ions sur des résines échangeuses d'ions telles que CM Sepharose Fast Flow et chromatographie de filtration sur gel sur des résines telles que Superdex 75.

Selon l'invention, il est proposé un nouvel ADN plasmidique multicopie recombinant pSX50, codant pour la synthèse de l'interféron leucocytaire humain alpha-2b, dont l'expression est sous le contrôle de promoteurs lactose et tryptophane et d'un terminateur de transcription. Le plasmide pSX50 compte 3218 paires de bases (pb) et se caractérise par la présence des fragments suivants :

La séquence de 1 nucléotide à 176 nucléotides (n) comprend un fragment d'ADN de 176 pb contenant le promoteur tryptophane (P trp) ;

Séquence de 177 après JC à 194 après JC comprend un fragment d'ADN synthétique de 18 pb contenant la séquence Shine Delgarno responsable de l'initiation de la traduction ;

Séquence de 195 après JC vers 695 après JC comprend un fragment d'ADN de 501 pb contenant la séquence du gène de l'interféron avec les substitutions de nucléotides suivantes : en position 37, A est remplacé par C ; en position 39, G est remplacé par T ; en position 40, A est remplacé par C ; et en position 42, G est remplacé par T , en position 67 changer A en C, en position 69 changer G en T, en position 70 changer A en C, en position 72 changer A en T, en position 96 changer G en A, en position 100 changer A en C, en position 102 changer A en T, en position 114 changer A en C, en position 120 changer C en G, en position 126 changer G en A, en position 129 changer G en A, en position 330 changer C en G, en position 339 changer de G en A, en position 342 changer de G en A, en position 487 changer de A en C, en position 489 changer de A en T, en position 495 changer de G en A;

Séquence de 696 après JC vers 713 après JC comprend un fragment d'ADN synthétique de 18 pb contenant un lieur multisite synthétique ;

Séquence de 714 après JC à 1138 après JC comprend un fragment d'ADN du plasmide pKK223-3 avec 4129 p.b. à 4553 après JC 425 pb, contenant la séquence du terminateur de transcription strict rrnBT 1 T 2 ;

Séquence de 1139 après JC à 1229 après JC comprend un fragment d'ADN du plasmide pUC19 de 2487 p.b. à 2577 après JC taille 91 p.O., contenant le promoteur du gène de la β-lactomase (gène de résistance à l'ampicilline - Amp R) ;

Séquence de 1230 après JC à 2045 a.d. comprend un fragment d'ADN du plasmide pUC4K avec 720 p.b. à 1535 après JC 816 pb de taille, contenant la région structurale du gène kan;

Séquence de 2046 après JC à 3218 après JC comprend un fragment d'ADN du plasmide pUC19 de 1625 à 453 p.b. taille 1173 BP, contenant la séquence responsable de la réplication du plasmide (ori) et le promoteur lac (P lac).

Les figures 1 à 5 montrent les schémas de construction et la carte physique du plasmide pSX50.

La figure 6 montre la séquence nucléotidique complète établie pour le plasmide pSX50.

La souche Escherichia coli SX50 a été obtenue en transformant des cellules Escherichia coli BL21 avec le plasmide pSX50 en utilisant la technologie traditionnelle du génie génétique. La souche E.Coli SX50 se caractérise par les caractéristiques suivantes.

Caractéristiques culturelles et morphologiques

Les cellules sont petites, droites, épaissies en forme de bâtonnet, gram-négatives, sans spores. Les cellules se développent bien sur des milieux nutritifs simples. Lors de la croissance sur de la gélose Difko, des colonies rondes, lisses, convexes, troubles, brillantes et grises se forment, avec des bords lisses. Lorsqu'ils poussent dans des milieux liquides (dans un milieu minimal avec du glucose ou dans un bouillon LB), ils forment un trouble intense et uniforme.

Caractéristiques physico-biologiques

Aérobie. La plage de températures de croissance est de 4 à 42 °C à un pH optimal de 6,5 à 7,5.

Les sels minéraux sous forme d'ammonium et de nitrate et les composés organiques sous forme d'acides aminés, de peptone, de tryptone, d'extrait de levure, etc. sont utilisés comme source d'azote.

Les acides aminés, le glycérol, les glucides sont utilisés comme source de carbone. Résistance aux antibiotiques. Les cellules présentent une résistance à la kanamycine (jusqu'à 100 µg/ml).

La souche Escherichia coli 8X50 est productrice d'interféron.

Méthode, conditions et composition du milieu de conservation de la souche

En L-arape avec addition de kanamycine à une concentration de 20 μg/ml sous huile, en bouillon L contenant 15% de glycérol et des antibiotiques appropriés en ampoules à une température de moins 70°C, à l'état lyophilisé en ampoules à une température de plus 4 ° C.

La souche Escherichia coli SX50 a été identifiée par Bergi's Key (1974) comme une souche de l'espèce Escherichia coli.

La méthode de production industrielle de l'interféron alpha-2b

Une caractéristique de la méthode proposée est le développement d'une technologie qui vous permet d'isoler l'interféron d'une forme insoluble qui s'accumule pendant la fermentation, ce qui peut considérablement simplifier le schéma technologique du processus d'isolement et augmenter le rendement du produit cible.

Le procédé consiste à cultiver la souche Escherichia coli SX50 dans un milieu nutritif, avec ajout constant de substrats nutritifs, de préférence glucose et extrait de levure, lors de la biosynthèse, de préférence avec une teneur réduite en tryptophane, destruction mécanique des cellules de micro-organismes à une pression élevée de 700 -900 bar, dissolution de l'interféron dans une solution tampon de chlorhydrate de guanidine, renaturation de l'interféron dans des solutions tampons physiologiques en présence d'agents chaotropiques, suivie d'une purification chromatographique en trois étapes de l'interféron sur des résines telles que la Chelating Sepharose Fast Flow immobilisée au Cu+2 ions, la chromatographie d'échange d'ions sur des résines échangeuses d'ions telles que CM Sepharose Fast Flow et la chromatographie de filtration sur gel sur des résines telles que Superdex 75.

Les conditions optimales pour la réalisation des étapes individuelles d'obtention de l'interféron sont les suivantes:

La fermentation est réalisée avec ajout continu de substrats tout au long du processus, ce qui conduit à un niveau élevé d'expression d'interféron ;

La destruction des cellules est réalisée dans un désintégrateur de type Gaulin à une pression de 900 bars ;

L'élimination des composants cellulaires solubles (ADN, ARN, protéines, lipopolysaccharides, etc.) est réalisée en lavant la forme insoluble de l'interféron avec des solutions tampons contenant des détergents (Triton XI00, urée, etc.);

Le précipité résultant contenant l'interféron est dissous dans une solution tampon de chlorhydrate de guanidine 6 M ;

La renaturation de l'interféron est réalisée dans une solution tampon physiologique contenant des agents chaotropes ;

La purification chromatographique en trois étapes de l'interféron est réalisée sur Sépharose chélatrice Fast Flow immobilisée avec des ions Cu+2, sur résine échangeuse de cations CM Sepharose Fast Flow et chromatographie par filtration sur gel sur résine type Superdex 75 ;

Après chaque purification chromatographique, une filtration stérilisante est réalisée sur des filtres apyrogènes de taille de pores 0,22 µm.

La production d'interféron à la suite de l'application de la méthode décrite est d'environ 400 à 800 mg d'interféron avec 1 litre de milieu de culture. La qualité du produit résultant est conforme aux normes et exigences de la "Pharmacopée européenne" pour la substance interféron alpha-2b.

Les différences significatives entre la méthode proposée et le prototype sont :

L'utilisation d'un design de souche à productivité plus élevée, qui permet d'obtenir une plus grande quantité d'interféron à partir de 1 litre de milieu de culture lors de la biosynthèse ;

L'utilisation d'une destruction mécanique efficace de la biomasse cellulaire, qui permet d'obtenir un extrait plus pur de la forme insoluble de l'interféron en un temps plus court, avec moins de perte ;

L'utilisation de solutions tampons physiologiques lors de la renaturation en présence d'agents chaotropes permet d'augmenter le rendement de la forme d'interféron correctement renaturée ;

La purification chromatographique en trois étapes de l'interféron permet d'obtenir une substance interféron de pureté supérieure à 99% selon l'électrophorèse en conditions réductrices et non réductrices lorsque les gels sont colorés à l'argent et à plus de 98% selon RF HPLC et pratiquement exempte de pyrogènes (test LAL).

L'essence et les avantages du groupe revendiqué d'inventions sont illustrés par les exemples suivants.

Exemple 1 Construction du plasmide recombinant pSX50

La méthode de construction du plasmide pSX50 comprend les étapes suivantes :

Construction du plasmide vecteur pSX10 ;

1. construction du plasmide pSX3 (2641 pb)

2. construction du plasmide vecteur pSX10 (2553 pb)

Construction du plasmide recombinant pSX41 (3218 pb) ;

Construction du plasmide recombinant pSX43 (3218 pb) ;

Construction du plasmide recombinant pSX45 (3218 pb) ;

Construction du plasmide recombinant pSX50 (3218 pb).

Construction du plasmide vecteur pSX10

Le plasmide vecteur pSX10 est un vecteur pUC19 dans lequel la séquence codante du gène bêta-lactamase de résistance à l'ampicilline est remplacée par la séquence codante du gène kan et contient le terminateur de transcription du plasmide pKK223-3.

La construction du plasmide vecteur pSS10 s'effectue en deux étapes :

Obtention du plasmide pSX3 (2641 p.O.), représentant le plasmide pUC19, dans lequel la région codante du gène amp est remplacée par la région codante du gène kan ;

Obtention d'un plasmide vecteur pSX10 (2553 pb), qui est un plasmide pSX3, dans lequel un fragment d'ADN codant pour le terminateur de transcription ggBT 1 T 2 est inséré derrière le site BamHI.

Pour obtenir le plasmide pSX3 passer cinq tours d'amplification d'ADN par PCR (amplification en chaîne par polymérase). Lors du premier tour, en utilisant l'ADN plasmidique pUC19 comme matrice, une amplification d'un fragment d'ADN de 1828 pb est réalisée. (fragment PU1-PU2) à l'aide d'amorces :

Cette réaction PCR et les suivantes sont réalisées dans les conditions suivantes : 20 mM Tis-HCl, pH 8,8, 10 mM (NH 4) 2 SO 4, 10 mM KCl, 2 tM MgCl 2 , 0,1 % Triton X100, 0,1 mg/ml BSA, 0,2 mM de chaque dNTP, 1,25 u Pfu ADN polymérase, 100 ng d'ADN. Le processus d'amplification comprend les étapes suivantes : chauffage à 95°C pendant 5 min, 35 cycles PCR (30 sec 95°C, 30 sec 56°C, 2 min 72°C) et incubation pendant 10 min à 72°C. Après amplification (et après amplifications ultérieures), le fragment d'ADN est purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 1%. Lors des deuxième et troisième tours, en utilisant l'ADN plasmidique pUC4K comme matrice, une amplification d'un fragment d'ADN de 555 pb est réalisée. (fragment KM1-KM2) à l'aide d'amorces :

et amplification d'un fragment d'ADN de 258 pb. (KMZ-KM4) avec amorces

Au cinquième tour de PCR, les fragments (PU1-PU2) et (KM1-KM4) sont combinés dans les conditions suivantes : chauffage à 95°C pendant 5 min, 5 cycles de PCR (30 sec 95°C, 30 sec 56° C, 10 min 72°C) et incubation pendant 10 min à 72°C. L'ADN obtenu après la dernière PCR est directement transformé dans des cellules E. coli DH5 et étalé sur milieu LA contenant 20 µg/ml de kanamycine. Après incubation pendant 12 heures à 37°C, les clones sont éliminés, l'ADN plasmidique est isolé et une analyse de restriction est effectuée. En conséquence, un plasmide pSX3 de 2641 pb est obtenu.

Pour obtenir le plasmide vecteur pSX10, trois cycles d'amplification d'ADN par PCR ont été réalisés. Lors du premier tour, en utilisant l'ADN plasmidique pSX3 comme matrice, une amplification d'un fragment d'ADN de 2025 pb est réalisée. (fragment 10.1-10.2) à l'aide d'amorces :

Au cours du deuxième tour, en utilisant l'ADN du plasmide pKK223-3 comme matrice, une amplification d'un fragment d'ADN de 528 pb est réalisée. (fragment KK1-KK2) à l'aide d'amorces :

Au troisième cycle de PCR, les fragments (10.1-10.2) et (KK1-KK2) sont combinés dans les conditions suivantes : chauffage à 95 °C pendant 5 min, 5 cycles de PCR (30 sec 95 °C, 30 sec 56 °C , 10 min 72°C) et incubation 10 min à 72°C. L'ADN obtenu après la dernière PCR est directement transformé dans des cellules E. coli DH5 et étalé sur milieu LA contenant 20 µg/ml de kanamycine. Après incubation pendant 12 heures à 37°C, les clones sont éliminés, l'ADN plasmidique est isolé et une analyse de restriction est effectuée. Le résultat est un plasmide pSX10 de 2553 pb.

Construction du plasmide recombinant pSX41

Le plasmide recombinant pSX41 est un fragment d'ADN Hind III - BamHI du plasmide vecteur pSX3 (2529 pb), un fragment d'ADN Hind III - EcoRI de 168 pb codant pour le promoteur de l'opéron tryptophane E. coli (P trp), EcoRI-XbaI un fragment de 20 pb un fragment d'ADN synthétique codant pour la séquence SD (Shine-Delgarno) et un fragment d'ADN XbaI-BamHI de 501 pb codant pour le gène de l'interféron alpha 2b humain.

Pour obtenir le fragment d'ADN HindIII - VamHI du plasmide vecteur pSX3 (2529 pb), l'ADN du plasmide pSX3 est traité avec les enzymes de restriction HindIII et BamHI suivi d'une purification électrophorétique dans un gel d'agarose à 1 %. Le fragment d'ADN Hind III EcoRI de 168 pb codant pour le promoteur de l'opéron tryptophane (P trp) a été obtenu par PCR en utilisant l'ADN total d'E. enzymes :

Pour obtenir EcoRI-Xbal, un fragment d'ADN synthétique de 20 pb codant pour la séquence SD (Shine-Delgarno), les oligonucléotides complémentaires suivants sont synthétisés :

Un fragment d'ADN XbaI-BamIII de 501 pb codant pour le gène de l'interféron alpha 2b humain est obtenu par PCR en utilisant l'ADN humain total comme matrice et les amorces IFN1 et IFN2, suivi d'un traitement du fragment amplifié avec les enzymes de restriction Xbal et BamIII :

Ensuite, les fragments purifiés par électrophorèse sont réunis, ligaturés avec l'enzyme ligase du phage T4, l'ADN est transformé dans des cellules E. coli DH5 et étalé sur milieu LA contenant 20 μg/ml de kanamycine. Après incubation pendant 12 heures à 37°C, les clones sont éliminés, l'ADN plasmidique est isolé, une analyse de restriction est effectuée et la structure primaire de l'ADN est déterminée. Le résultat est un plasmide pSX41 de 3218 pb. Ensuite, une mutagenèse par étapes du gène de l'interféron est effectuée pour augmenter le niveau d'expression du produit cible. La mutagénèse du gène de l'interféron consiste en le remplacement de triplets rarement rencontrés chez E. coli, codant pour les acides aminés correspondants, par des triplets fréquemment retrouvés chez E. coli, codant pour les mêmes acides aminés. La mutagenèse de l'ADN du gène de l'interféron est réalisée par PCR.

Construction du plasmide recombinant pSX43

Pour obtenir le plasmide recombinant pSX43, un cycle d'amplification d'ADN est réalisé par PCR, en utilisant l'ADN du plasmide pSX41 comme matrice et les amorces IFN3 et IFN4 :

La PCR est réalisée dans les conditions suivantes : chauffage à 95°C pendant 5 min, 20 cycles de PCR (30 sec 95°C, 30 sec 56°C, 10 min 72°C) et incubation pendant 20 min à 72°C. L'ADN obtenu après PCR est directement transformé dans des cellules E. coli DH5 et étalé sur milieu LA contenant 20 µg/ml de kanamycine. Après incubation pendant 12 heures à 37°C, les clones sont éliminés, l'ADN plasmidique est isolé, une analyse de restriction est effectuée et la structure primaire de l'ADN est déterminée. En conséquence, un plasmide pSX43 de 3218 pb est obtenu.

Construction du plasmide recombinant pSX45

Pour obtenir le plasmide recombinant pSX45, un cycle d'amplification d'ADN par PCR est effectué en utilisant l'ADN du plasmide pSX43 comme matrice et les amorces IFN5 et IFN6 :

La PCR est réalisée dans les conditions suivantes : chauffage à 95°C pendant 5 min, 20 cycles de PCR (30 sec 95°C, 30 sec 56°C, 10 min 72°C) et incubation pendant 20 min à 72°C. L'ADN obtenu après PCR est directement transformé dans des cellules E. coli DH5 et étalé sur milieu LA contenant 20 µg/ml de kanamycine. Après incubation pendant 12 heures à 37°C, les clones sont éliminés, l'ADN plasmidique est isolé, une analyse de restriction est effectuée et la structure primaire de l'ADN est déterminée. Le résultat est un plasmide pSX45 de 3218 pb.

Construction du plasmide recombinant pSX50.

Pour obtenir le plasmide recombinant pSX50, un cycle d'amplification d'ADN par PCR est effectué en utilisant l'ADN du plasmide pSX45 comme matrice et les amorces IFN7 et IFN8 :

La PCR est réalisée dans les conditions suivantes : chauffage à 95°C pendant 5 min, 20 cycles de PCR (30 sec 95°C, 30 sec 56°C, 10 min 72°C) et incubation pendant 20 min à 72°C. L'ADN obtenu après PCR est directement transformé dans des cellules E. coli DH5 et étalé sur milieu LA contenant 20 µg/ml de kanamycine. Après incubation pendant 12 heures à 37°C, les clones sont éliminés, l'ADN plasmidique est isolé, une analyse de restriction est effectuée et la structure primaire de l'ADN est déterminée. Le résultat est un plasmide pSX50 de 3218 pb.

Exemple 2. Obtention d'une souche d'E. coli SX50 - productrice d'interféron

La souche productrice d'interféron E. coli SX50 est obtenue par transformation de cellules de la souche E. coli BL21 avec le plasmide pSX50 recombinant. La souche productrice d'interféron est cultivée dans un fermenteur de 30 L jusqu'à une densité optique de 25,0 à 30,0 o.u. dans du milieu M9 contenant 1 % d'hydrolysat acide de caséine (Difco), 1 % de glucose, 40 µg/ml de kanamycine, à une température de 38-39°C. Pendant le processus de fermentation, un ajout continu de substrat nutritif est effectué à l'aide d'un contrôleur gravimétrique.

Exemple 3 Méthode d'isolement de l'interféron à partir de la souche E. coli SX50

L'interféron a été obtenu en 4 étapes :

Étape 1. Culture de la souche E. coli SX50.

Étape 2. Isolement et purification de la forme insoluble de l'interféron.

Étape 3. Dissolution et renaturation de l'interféron.

Étape 4. Purification chromatographique de l'interféron.

Étape 1. Culture de la souche E. coli SX50

L'inoculum cultivé de la souche E. coli SX50 dans un volume de 3 litres de milieu LB riche pendant 12 heures à 26°C est introduit aseptiquement dans un fermenteur contenant 27 litres d'un milieu stérile contenant du M9, hydrolysat acide de caséine 1%, 1 % de glucose, 1 mm de MgCl2, 0,1 mM de CaCl2, 40 mg/mL de kanamycine. La culture en fermenteur est effectuée à une température de 38-39°C, en maintenant un pH de 7 ± 0,15 par titrage automatique avec une solution de soude à 40 %. La concentration d'oxygène dissous dans la plage (50 ± 10) % de saturation est maintenue en modifiant la vitesse de l'agitateur de 100 à 800 tr/min et l'alimentation en air de 1 à 15 l/min. La concentration des substrats, en particulier le glucose et l'extrait de levure, est mesurée pendant la fermentation et leur concentration est maintenue en modifiant le débit d'alimentation des solutions concentrées à travers des pompes péristaltiques à l'aide d'un contrôleur gravimétrique.

L'accumulation d'interféron sous forme insoluble est suivie par microscopie à contraste de phase, électrophorèse en gel de polyacrylamide 15% (SDS-PAAG) et chromatographie haute performance en phase inverse (RF HPLC). La fermentation est arrêtée après avoir atteint la densité optique maximale (~ 25-30 p.u.) et arrêté la synthèse d'interféron. A la fin de la fermentation, le liquide de culture est séparé par centrifugation dans un rotor à flux à une vitesse de rotation de 5000-10000 rpm. La biomasse est conditionnée dans des sacs plastiques et congelée à moins 70°C.

Étape 2. Isolement et purification de la forme insoluble de l'interféron

300-400 g de biomasse congelée d'E. coli SX50 sont mis en suspension dans 3000 ml de tampon 1 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,1 % Triton X100). La suspension est passée dans un homogénéisateur à flux de type Gaulin, maintenu à 900 bars et centrifugé dans un rotor à flux à 15 000 rpm. Le précipité obtenu est lavé successivement dans des conditions similaires avec les tampons 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 3 M urée) et le tampon 3 (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) et enfin l'interféron le précipité est mis en suspension dans 200 ml de tampon 3. Le temps d'isolement et de purification de la forme insoluble de l'interféron ne dépasse pas 5 heures.

Étape 3. Dissolution et renaturation de l'interféron

A la suspension de la forme insoluble d'interféron obtenue à l'étape précédente à une concentration de 6 M, on ajoute du chlorhydrate de guanidine sec, du dithiothréitol à une concentration de 50 mM, du Tris-HCl pH 8,0 à une concentration de 50 mM, du NaCl à une concentration de 150 mM et Triton X100 à une concentration de 0,1%, incubés à température ambiante pendant 2 heures.Le matériel non dissous est séparé par filtration stérilisante à travers des membranes avec des diamètres de pores de 0,22 microns.

La renaturation de l'interféron est effectuée en diluant lentement la solution résultante 100 à 200 fois avec le tampon 4 (Tris-HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 0,1 mM). Après cela, le mélange de renaturation est incubé sous agitation constante pendant 12 à 15 heures à une température de 4 à 8°C. Ensuite, du sulfate de magnésium est ajouté à une concentration de 1 mm et le matériau agrégé est éliminé par filtration stérilisante à travers un filtre à membrane avec un diamètre de pores de 0,22 microns.

Étape 4. Purification chromatographique de l'interféron

La purification chromatographique de l'interféron est réalisée en trois étapes.

1. L'interféron renaturé résultant est d'abord purifié par chromatographie d'affinité sur une résine Chelating Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) immobilisée avec des ions Cu+2. Pour ce faire, la solution d'interféron est appliquée sur une colonne de Cu+2 Chelating Sepharose Fast Flow et l'interféron est élué avec un tampon d'acide citrique 0,1 M pH 2,2.

2. Lors de la deuxième étape de la purification chromatographique, la solution d'interféron est appliquée sur une résine échangeuse de cations CM Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) et l'interféron est élué avec un gradient de solutions (0,0-0,5 M NaCl) dans 50 mM NaCl Tampon (CH 3 COO) pH 5,5.

3. La purification de la forme monomérique de l'interféron à partir des restes de formes polymériques de l'interféron est réalisée à la troisième étape de purification de l'interféron par gel filtration sur résine de type Superdex 75 (Amersham Biosciences). La chromatographie est réalisée dans un tampon Na(CH 3 COO) 50 mM, pH 5,0, contenant 0,15 M NaCl.

La méthode décrite pour isoler et purifier l'interféron permet d'obtenir 4 à 8 g d'interféron hautement purifié en un cycle d'isolement pendant 7 à 10 jours à partir de la biomasse obtenue à partir de 10 l de milieu de culture. La qualité de l'interféron obtenu est entièrement conforme aux exigences de la "Pharmacopée européenne" pour la substance de l'interféron alfa-2b, à savoir :

La concentration d'interféron n'est pas inférieure à 2 × 10 8 UI/ml;

L'activité spécifique de l'interféron n'est pas inférieure à 2,0 × 10 8 UI/mg ;

La pureté électrophorétique du médicament n'est pas inférieure à 99 % dans des conditions réductrices et non réductrices lorsque les gels sont colorés à l'argent ;

Le point isoélectrique de l'interféron isolé se situe dans la région de pH 5,8-6,3 ;

La carte peptidique de l'interféron isolé ne diffère pas fondamentalement de la carte peptidique de la norme européenne pour l'interféron alfa 2b SCR ;

Comme il ressort des exemples ci-dessus, le groupe d'inventions revendiqué permet d'obtenir l'interféron alpha-2b avec un rendement élevé avec une technologie relativement simple et fiable.

RÉCLAMER

1. ADN plasmidique recombinant pSX50 codant pour la synthèse de l'interféron alpha-2b humain recombinant, caractérisé en ce qu'il a une taille de 3218 paires de bases (pb) et est constitué des fragments suivants : la séquence de 1 à 176 nucléotides (n) comprend un fragment d'ADN de 176 pb contenant un promoteur tryptophane (P trp), séquence de 177 à 194 pb. comprend un fragment d'ADN synthétique de 18 pb, contenant la séquence Shine Delgarno responsable de l'initiation de la traduction, la séquence de 195 à 695 pb. comprend un fragment d'ADN de 501 pb contenant le gène de l'interféron alpha-2b avec des substitutions de nucléotides : 37 (A>C), 39 (G>T), 40 (A>C), 42 (G>T), 67 (A>C ), 69 (G>T), 70 (A>C), 72 (A>T), 96 (G>A), 100 (A>C), 102 (A>T), 114 (A >C) , 120 (C>G), 126 (G>A), 129 (G>A), 330 (C>G), 339 (G>A), 342 (G>A), 487 (A>C), 489 (A>T), 495 (G>A), séquence 696 à 713 p.b. comprend un fragment d'ADN synthétique de 18 bp contenant un polylinker synthétique, séquence de 714 à 1138 bp. comprend un fragment d'ADN du plasmide pKK223-3 de 4129 à 4553 p.b. 425 pb, contenant la séquence du terminateur de transcription strict rrnBT 1 T 2 , la séquence de 1139 à 1229 p.b. comprend un fragment d'ADN du plasmide pUC19 de 2487 à 2577 p.b. Taille de 91 pb, contenant le promoteur du gène de la β-lactomase (gène de résistance à l'ampicilline -Amp R), séquence de 1230 à 2045 p.b. comprend un fragment d'ADN du plasmide pUC4K avec 720 p.b. à 1535 après JC 816 pb de taille, contenant la région structurale du gène kan, séquence de 2046 p.b. à 3218 après JC comprend un fragment d'ADN du plasmide pUC19 de 1625 à 453 p.b. taille 1173 BP, contenant la séquence responsable de la réplication du plasmide (ori) et le promoteur lac (P lac).

2. La souche bactérienne Eschcerichia coli SX50 transformée avec le plasmide recombinant selon la revendication 1 est productrice d'interféron alpha-2b leucocytaire humain recombinant.

3. Procédé de production d'interféron alpha-2b humain, qui comprend la culture de la souche Escherichia coli SX5 selon la revendication 2 dans un milieu nutritif avec ajout constant de substrats nutritifs lors de la biosynthèse, destruction mécanique des cellules de microorganismes à une pression de 700-900 bar , dissolution de l'interféron dans une solution tampon de chlorhydrate de guanidine, renaturation de l'interféron dans des solutions tampons physiologiques en présence d'agents chaotropiques, purification chromatographique en trois étapes de l'interféron sur des résines telles que Chelating Sepharose Fast Flow immobilisée avec des ions Cu +2, chromatographie échangeuse d'ions sur des résines échangeuses d'ions telles que CM Sepharose Fast Flow et chromatographie d'exclusion stérique sur des résines telles que Superdex 75 .

4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel la culture est réalisée sur un milieu nutritif à teneur réduite en tryptophane avec addition continue de substrats nutritifs, de préférence glucose et extrait de levure.

5. Procédé selon la revendication 3, dans lequel, avant dissolution de l'interféron, celui-ci est purifié par élimination des composants cellulaires solubles, notamment ADN, ARN, protéines, lipopolysaccharides, lavage avec des solutions tampons contenant des détergents tels que le Triton XI 00, des urées.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, dans lequel après chaque purification chromatographique, une filtration stérilisante est réalisée sur des filtres de porosité 0,22 µm.