L'analyse sérologique diagnostique pour détecter les anticorps dirigés contre les antigènes Vi de l'agent causal de la fièvre typhoïde dans le sérum sanguin est destinée à confirmer ou à infirmer le fait du portage.
| Délais | 7-8 jours |
| Synonymes (rus) | Analyse sérologique des anticorps Vi de l'agent causal de la fièvre typhoïde dans le sérum sanguin |
| Synonymes (eng) | Test d'hémagglutination indirecte pour les anticorps Salmonella typhi Vi |
| Méthode d'analyse |
La réaction d'hémagglutination indirecte (RIHA) |
| Préparation aux études | L'analyse est effectuée le matin, à jeun. Au moins 8 heures doivent s'être écoulées depuis le dernier repas. |
| Exclure la consommation d'alcool au moins 24 heures avant de prendre le biomatériau. | |
| Il n'est pas recommandé de donner du sang pour la sérologie après une fluorographie, des radiographies, des procédures de physiothérapie. |
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| Biomatériau et méthodes de prélèvement | Sang désoxygéné |
Informations générales sur la fièvre typhoïde et sa détection
La fièvre typhoïde fait référence aux maladies infectieuses aiguës de l'intestin. Elle se caractérise par une évolution cyclique avec des lésions systémiques des organes intestinaux, du système nerveux central, du foie, du système lymphatique ; intoxication générale du corps, bactériémie stable, dans laquelle la présence de bactéries est détectée dans le sang. La source d'infection sont des porteurs malades et malades.
L'agent causal de la fièvre typhoïde - Salmonella typhi, fait référence aux bactéries intestinales.
Le système antigénique de l'agent pathogène est représenté par les antigènes O, H, Vi.
L'antigène Vi est l'antigène de virulence, formant la résistance de l'agent causal de la salmonelle typhoïde aux réactions protectrices de l'organisme. La présence d'anticorps dirigés contre les antigènes Vi de Salmonella typhi lors d'une étude sérologique d'échantillons sanguins sert de marqueur de bactérioporteur.
Méthode de test sanguin Vi-antigène
La détection des anticorps dirigés contre les antigènes Vi des érythrocytes est réalisée à l'aide de réaction sérologique d'hémagglutination indirecte, RNGA à l'aide de diagnostics spéciaux.
Méthode RNGA:
- basé sur la capacité d'interaction des anticorps sériques sanguins et des antigènes fixés sur les érythrocytes (diagnostic érythrocytaire); le résultat de la réaction est l'agrégation des globules rouges, suivie d'une sédimentation, d'une agglutination ;
- par la nature du sédiment érythrocytaire, on juge la présence d'anticorps (un "parapluie" caractéristique), ou leur absence (un précipité en forme de "point");
- est semi-quantitatif ; pour effectuer la réaction, des dilutions de sérum sanguin sont utilisées pour détecter un titre diagnostique;
- le titre diagnostique minimum pendant la réaction est de 1:40 ;
- une augmentation de la valeur diagnostique de la réaction est observée lors de l'utilisation d'analyses répétées (méthode des sérums appariés);
- la réaction est très sensible et spécifique, peut être utilisée du cinquième au septième jour de la maladie.
L'objectif principal de l'étude est d'identifier le bactérioporteur de la salmonelle typhoïde.
Résultats d'analyse et leur interprétation
Les résultats des tests peuvent être positifs ou négatifs.
Réponse positive:
- la détection d'anticorps dirigés contre les antigènes Vi de l'agent pathogène typhoïde dans le sang (la valeur minimale du titre diagnostique est de 1:40) est considérée comme une indication du fait d'un bactérioporteur et de la nécessité d'un nouveau test;
- la valeur du titre est fixée dans la réponse ;
- peut indiquer l'évolution d'une infection aiguë, d'une maladie passée, d'une vaccination ;
- dans de rares cas, il peut s'agir d'un faux positif en raison d'une réactivité croisée.
La réalisation de cette étude revêt une importance particulière pour prévenir les cas de propagation de la fièvre typhoïde par des bactéries porteuses.
Période d'analyse : jusqu'à 7 jours
Le coût de l'analyse : 710 roubles.
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Questions et réponses
Le coût des analysesQuestion: Bonjour! Veuillez écrire le coût des tests suivants. Je prévois de louer à Sotchi Staronasypnaya st., 22, microdistrict Adler, BC Office Plaza, fl. 2 Pour une femme : 1. Échographie des organes pelviens du 5e au 8e jour du cycle menstruel. 2. Détermination du groupe sanguin (y compris le facteur Rh). 3. Test sanguin clinique, y compris coagulation sanguine 4. Test sanguin biochimique (y compris glucose, protéines totales, bilirubine directe et indirecte, urée) 5. Test sanguin pour la syphilis, le VIH, l'hépatite B et C 6. Coagulogramme (selon les indications) 7 Analyse générale des urines 8. Étude de l'état de l'utérus et des trompes de Fallope (laparoscopie, hystérosalpingographie ou hystérosalpingoscopie) - selon les indications. 9. Examen infectieux : - examen bactériologique des pertes vaginales, du canal cervical de l'urètre (frottis pour la flore) - examen microscopique du canal cervical à séparer pour les micro-organismes aérobies et anaérobies facultatifs, Trichomonas, champignons du genre Candida (inoculation de le canal cervical) - PCR (chlamydia, urée- et mycoplasmes, virus de l'herpès simplex types I-II, cytomégalovirus) (canal cervical) - détermination des anticorps de classe M, G contre le toxoplasme, la rubéole (sang) 10. ECG 11. Fluorographie des poumons (valable 12 mois). 12. Consultation du thérapeute 13. Colposcopie et examen cytologique du col de l'utérus. 14. Mammographie (pour les femmes de plus de 35 ans), échographie des glandes mammaires (pour les femmes de moins de 35 ans). 15. Analyse chromosomique pour les couples mariés de plus de 35 ans, les femmes ayant des antécédents de malformations congénitales et de maladies chromosomiques, y compris les parents proches ; femmes en aménorrhée primaire. 16. Hystéroscopie et biopsie de l'endomètre (selon les indications). 17. Examen hormonal : sang aux jours 2 à 5 du cycle menstruel : LH, FSH, prolactine, testostérone (st., total), estradiol, progestérone, cortisol (800-1700), T3 sv, T4 sv, TSH, STH , AMG, 17-OP, DGA-S. sang au jour 20-22 du cycle : progestérone. 18. Consultation avec un endocrinologue (selon les indications). 19. Conclusion de spécialistes spécialisés en présence de pathologie extragénitale (selon les indications). 20. Échographie de la glande thyroïde et des glandes parathyroïdes, des reins et des glandes surrénales (selon les indications). Pour un homme : 1. Test sanguin pour la syphilis, le VIH, les hépatites B et C (les tests sont valables 3 mois). 2. Spermogramme et test MAP 3. Examen microscopique de l'éjaculat à la recherche de micro-organismes aérobies et anaérobies facultatifs, Trichomonas, champignons du genre Candida (culture d'éjaculat) (les tests sont valables 6 mois). 4. PCR (chlamydia, urée et mycoplasmes, virus de l'herpès simplex de types I-II, cytomégalovirus) (éjaculat). 5. Consultation andrologue/urologue.
Réponse:
Bonjour! Coût de la prestation :
Pour femme:
1. Échographie des organes pelviens du 5e au 8e jour du cycle menstruel. - 1500 roubles.
2. Détermination du groupe sanguin (y compris le facteur Rh). - 490 roubles.
3. Test sanguin clinique, - 460 roubles. y compris la coagulation du sang (étude du temps de saignement (temps de saignement/coagulation)) - 220 roubles.
4. Test sanguin biochimique (y compris glucose - 159 roubles, protéines totales - 159 roubles, direct - 159 roubles et bilirubine indirecte - 159 roubles, urée - 159 roubles)
5. Test sanguin pour la syphilis, le VIH, l'hépatite B et C - 1560 roubles.
6. Coagulogramme (selon les indications) - 820 roubles.
Le RGA est basé sur la capacité des érythrocytes à se serrer les coudes lorsque certains antigènes sont adsorbés sur eux. Le liquide allantoïque, amniotique, la suspension de membranes chorionallantoïques d'embryons de poulet, les suspensions et extraits de cultures ou d'organes d'animaux infectés par des virus, le matériel infectieux natif sont utilisés comme matériel de test pour l'hémagglutination. Le RGA n'est pas sérologique, car il se produit sans la participation de sérum immun et est utilisé pour sélectionner la dilution de travail de l'antigène pour le réglage du RTGA ou la présence d'un antigène (virus) dans le matériel de test (par exemple, avec la grippe). La réaction utilise des érythrocytes d'animaux, d'oiseaux, de groupe sanguin humain I (0).
Pour établir un RGA approximatif, une goutte de suspension à 5% d'érythrocytes et une goutte du matériel d'essai sont appliquées sur une lame de verre, soigneusement mélangées. Avec un résultat positif, après 1 à 2 minutes, observez macroscopiquement l'apparition d'une agglutination floculante des érythrocytes.
Pour mettre en place RHA dans une rangée expansée dans les puits de plaques de polystyrène, des dilutions doublement croissantes du matériel à tester dans une solution physiologique dans un volume de 0,5 ml sont préparées. Dans tous les tubes, verser 0,5 ml de suspension à 0,25 - 1% d'érythrocytes. Les résultats sont pris en compte après sédimentation complète des érythrocytes dans le témoin (érythrocytes + solution saline). La réaction est prise en compte par la nature du sédiment érythrocytaire. Dans les cas positifs, le degré d'agglutination est marqué d'avantages. Quatre plus évaluent la réaction, qui a la forme d'un film mince d'érythrocytes collés recouvrant le fond du tube à essai (parapluie), la réaction avec des lacunes dans le film est marquée de trois plus, la présence d'un film avec des bords en dentelle festonnés d'érythrocytes collés est indiqué par deux plus, un sédiment floconneux d'érythrocytes entouré d'une zone d'érythrocytes agglutinés correspond à un plus. Un sédiment érythrocytaire bien défini, indiscernable du témoin, montre l'absence d'agglutination. Le titre est considéré comme la dilution limite du matériel d'essai, qui a provoqué l'agglutination des érythrocytes par deux plus.
Avec un résultat positif de RHA, l'étude est poursuivie en déterminant le type de virus isolé à l'aide du test d'inhibition de l'hémagglutination avec des sérums spécifiques de type.
La RTGA est basée sur la propriété de l'antisérum de supprimer l'hémagglutination virale, puisque le virus neutralisé par des anticorps spécifiques perd sa capacité à agglutiner les globules rouges. Pour le typage approximatif des virus, la méthode de la goutte sur verre est utilisée. Pour la détermination finale du type d'affiliation du virus isolé et le titrage des anticorps dans les sérums, un RTHA expansé est placé dans des tubes à essai ou dans des puits. A cet effet, des dilutions au 1/2 de sérums sont préparées dans du sérum physiologique et versées dans 0,25 ml. Une goutte du matériel contenant le virus et une goutte de suspension d'érythrocytes à 1 % sont ajoutées aux dilutions de sérum.
Lors de l'utilisation de la RTGA pour déterminer le type de virus, des sérums spécifiques au type sont utilisés, qui sont ajoutés à un volume égal de la dilution de travail de l'antigène. L'affiliation type du virus isolé est déterminée par le sérum immun spécifique, qui a montré le titre le plus élevé d'anticorps contre ce virus.
RGA et RTGA sont largement utilisés pour diagnostiquer les infections virales (encéphalite à tiques, grippe, etc.) afin de détecter des anticorps spécifiques et d'identifier de nombreux virus par leurs antigènes.
Principe RTGA consiste dans le fait que des volumes égaux de sérum sanguin et de suspension virale sont mélangés dans un tube à essai, et après exposition, il est déterminé si le virus est conservé dans le mélange en ajoutant une suspension d'érythrocytes. L'agglutination des érythrocytes indique la présence et l'absence d'hémagglutination indique l'absence du virus dans le mélange. La disparition du virus du mélange virus + sérum est considérée comme un signe de l'interaction du sérum et des anticorps anti-virus.
Mais les anticorps interagissent avec les antigènes dans des rapports quantitatifs strictement définis. Par conséquent, pour qu'une certaine quantité de virus soit privée de capacité d'hémagglutination, un certain minimum d'anticorps est requis, et comme l'un des composants du RTHA est toujours inconnu, il est nécessaire de mettre la réaction dans une série de tubes à essai avec différentes doses d'anticorps et les mêmes doses de virus, ou vice versa. Ceci est réalisé en prenant soit différentes dilutions de sérum et la même dilution de virus, soit différentes dilutions de virus et la même dilution de sérum.
RTGA vous permet de résoudre les tâches suivantes : déterminer le titre d'anticorps dirigés contre le virus hémagglutinant dans le sérum ; identifier un virus hémagglutinant inconnu à partir de sérums connus ; établir le degré de parenté antigénique des deux virus.
Avantages du RTGA : simplicité de la technique, rapidité, travail stérile non requis, spécificité, faible coût. Inconvénient : RTGA n'est possible qu'avec des virus hémagglutinants.
Le principe du titrage des anticorps en RTGA se compose des éléments suivants :
- préparer une série de dilutions séquentielles (habituellement de 2 fois) du sérum à tester en volumes égaux (habituellement 0,25 ou 0,2 ml) ;
– ajouter à chaque dilution les mêmes volumes de virus homologue titrant 4 HAU ;
– les mélanges sont conservés pendant un certain temps à une certaine température (pour le virus de la maladie de Newcastle 40-60 minutes à température ambiante) ;
– des volumes égaux de suspension à 1 % d'érythrocytes lavés sont ajoutés à tous les mélanges ;
- après exposition, l'hémagglutination de chaque mélange est évaluée en croisements.
La réaction comprend des contrôles de sérum, de virus et d'érythrocytes.
Cette dilution de sérum la plus élevée, qui inhibe toujours complètement l'hémagglutination, est prise comme indicateur du titre d'anticorps dans ce sérum.
Utilisation en virologie de la réaction d'hémadsorption.
RGAd. L'hémadsorption - la connexion des érythrocytes à la surface des cellules affectées par le virus - a été découverte pour la première fois par Vogel et Shchelokov (1957) sur une culture tissulaire infectée par le virus de la grippe. Ce phénomène est basé sur l'affinité des récepteurs viraux situés à la surface de la cellule affectée avec les récepteurs érythrocytaires, ce qui conduit à leur liaison mutuelle similaire à la réaction d'hémagglutination. L'avantage de cette réaction est qu'elle devient positive avant même l'apparition de changements cytopathiques distincts dans les cellules infectées.
Méthodologie RGAd se compose des éléments suivants. Le 3ème-4ème jour après l'infection cellulaire, deux tubes avec la même culture cellulaire sont prélevés, dont l'un est infecté par du matériel contenant du virus et le second est un tube témoin. Le liquide de culture est drainé des deux tubes à essai et 2 à 3 gouttes de suspension à 0,5 % d'érythrocytes lavés sont ajoutées aux deux tubes. Les deux tubes sont laissés pendant 5 à 10 minutes pour que les érythrocytes soient à la surface des cellules (placés horizontalement sur la table), puis légèrement rincés avec une solution saline et examinés au microscope (petit grossissement). Dans le tube de contrôle, les érythrocytes sont complètement éliminés avec une solution saline et certains des autres flottent avec le liquide. Si les érythrocytes dans le tube à essai infecté ne sont pas éliminés avec une solution saline et ne flottent pas, mais sont attachés à la surface des cellules, le RHAd doit être considéré comme positif.
Selon le virus et le type de cellules, la disposition des globules rouges peut être triple :
- les érythrocytes ne sont adsorbés qu'en périphérie de la couche cellulaire sous forme de "collier" (virus de la peste porcine africaine) ;
- les érythrocytes sont situés sur la couche cellulaire en foyers ou en grappes (virus de la grippe) ;
- les érythrocytes sont localisés de manière diffuse sur la couche cellulaire (virus parainfluenza).
Chaque virus est capable d'adsorber les globules rouges de certaines espèces animales.
Diagnostic sérologique des maladies virales par l'augmentation du titre d'anticorps dans les sérums sanguins appariés.
Réaction d'hémagglutination (RGA) et réaction d'inhibition de l'hémagglutination (HITA), mécanisme, composants et application des réactions.
La base de la réaction d'hémagglutination est le phénomène d'agglutination des érythrocytes, qui se produit sous l'influence de divers facteurs. Distinguer entre hémagglutination directe et indirecte.
Tout d'abord, les érythrocytes sont lavés avec une solution isotonique de chlorure de sodium, puis, si nécessaire (lors de l'utilisation d'antigènes de nature protéique), ils sont traités avec une solution de tanin 1: 20 000 et sensibilisés avec des antigènes solubles. Après lavage avec une solution isotonique tamponnée de chlorure de sodium, l'antigène érythrocytaire est prêt à l'emploi.
Les sérums à tester sont dilués avec une solution isotonique de chlorure de sodium dans des tubes à essai ou des plaques en plastique spéciales trouées, puis un diagnosticum érythrocytaire est ajouté à chaque dilution de sérum. Les résultats de la réaction d'hémagglutination indirecte sont pris en compte par la nature du sédiment érythrocytaire formé au fond du tube. Le résultat de la réaction est considéré comme positif, dans lequel les érythrocytes couvrent uniformément tout le fond du tube à essai. Avec une réaction négative, les globules rouges sous la forme d'un petit disque ou "bouton" sont situés au centre du fond du tube à essai.
Les principaux composants du RP :
A) antigène soluble
B) Anticorps spécifiques (sérum)
(RTGA) est une méthode d'identification d'un virus ou de détection d'anticorps antiviraux dans le sérum sanguin du patient, basée sur le phénomène d'absence d'agglutination des érythrocytes par un médicament contenant un virus en présence de sérum sanguin immun contre celui-ci.
est basé sur le blocage, la suppression des antigènes des virus par les anticorps du sérum immun, à la suite de quoi les virus perdent leur capacité à agglutiner les globules rouges.
La RTHA est utilisée pour diagnostiquer de nombreuses maladies virales dont les agents responsables (grippe, rougeole, rubéole, encéphalite à tiques, etc.) peuvent agglutiner les érythrocytes de divers animaux.
Mécanisme. Le typage du virus est effectué dans le test d'inhibition de l'hémagglutination (HITA) avec un ensemble de sérums spécifiques de type. Les résultats de la réaction sont pris en compte par l'absence d'hémagglutination. Sous-types de virus A avec les antigènes H0N1, H1N1, H2N2, H3N2, etc.
peut être différencié en RTGA avec un ensemble de sérums spécifiques de type homologues.
Au coeur réactions d'hémagglutination réside le phénomène d'agglutination des érythrocytes, qui se produit sous l'influence de divers facteurs.
Distinguer entre hémagglutination directe et indirecte.
Dans la réaction d'hémagglutination directe, les érythrocytes se collent lorsque certains antigènes, tels que les virus, sont adsorbés sur eux.
Dans les études sérologiques, la réaction d'inhibition directe de l'hémagglutination est utilisée, lorsque le virus isolé du patient est neutralisé avec un sérum immun spécifique, puis combiné avec des globules rouges.
L'absence d'hémagglutination indique la correspondance du virus et du sérum immun utilisé.
Une réaction d'hémagglutination indirecte (hémagglutination passive) est observée lorsque des érythrocytes prétraités (sensibilisés) avec divers antigènes sont supplémentés avec du sérum immun ou du sérum du patient qui contient les anticorps appropriés.
Il existe une liaison spécifique des érythrocytes, leur hémagglutination passive.
La réaction d'hémagglutination indirecte ou passive est supérieure en sensibilité et en spécificité aux autres méthodes sérologiques, et elle est utilisée dans le diagnostic des infections causées par des bactéries, des rickettsies et des protozoaires.
La méthode de réglage de la réaction d'hémagglutination indirecte comprend plusieurs étapes.
Tout d'abord, les érythrocytes sont lavés avec une solution isotonique de chlorure de sodium, puis, si nécessaire (lors de l'utilisation d'antigènes de nature protéique), ils sont traités avec une solution de tanin 1: 20 000 et sensibilisés avec des antigènes solubles.
Après lavage avec une solution isotonique tamponnée de chlorure de sodium, l'antigène érythrocytaire est prêt à l'emploi. Les sérums à tester sont dilués avec une solution isotonique de chlorure de sodium dans des tubes à essai ou des plaques en plastique spéciales trouées, puis un diagnosticum érythrocytaire est ajouté à chaque dilution de sérum.
Les résultats de la réaction d'hémagglutination indirecte sont pris en compte par la nature du sédiment érythrocytaire formé au fond du tube. Le résultat de la réaction est considéré comme positif, dans lequel les érythrocytes couvrent uniformément tout le fond du tube à essai. Avec une réaction négative, les érythrocytes sous la forme d'un petit disque ou «bouton» sont situés au centre du fond du tube à essai.
Réaction d'inhibition de l'hémagglutination- une réaction sérologique basée sur la capacité des anticorps à empêcher l'agglutination des érythrocytes par des types de virus hémagglutinants (adénovirus, arbovirus, certains entérovirus, virus influenza et parainfluenza, rougeole, réovirus).
Des anticorps antiviraux spécifiques interagissent avec les molécules de surface des hémagglutinines des virions de ces virus et bloquent leur liaison aux molécules complémentaires de la membrane érythrocytaire.
Récemment, la réaction a été largement utilisée dans les laboratoires de virologie clinique pour déterminer les titres d'anticorps spécifiques à certains virus, ainsi que pour l'identification sérologique et le typage d'isolats de virus à partir de matériel clinique de patients.
L'utilisation est quelque peu limitée en raison de la présence dans le sérum sanguin de personnes d'inhibiteurs non spécifiques de virus, ainsi que d'anticorps naturels - les agglutinines.
Réaction de neutralisation - réaction d'inhibition de l'hémagglutination (RTGA).
RTGA est appliqué :
-pour le sérotypage viral ;
- pour le sérodiagnostic des infections.
Il existe deux manières de paramétrer :
- méthode goutte à goutte sur verre (réaction approximative), utilisée pour la sérocopie des virus ;
- déployé dans des éprouvettes.
Mécanisme.
Certains virus (par exemple, la grippe) contiennent de l'hémagglutinine, qui provoque l'agglutination des érythrocytes de divers animaux, selon le type de virus.
En présence d'anticorps dans le sérum - antihémagglutinines, on observe une inhibition de l'activité des virus.
RTGA.
Objet : sérotypage du virus de la grippe A
Composants:
1. Le matériel étudié est le liquide allantoïdien de l'embryon de poulet,
2. Sérums spécifiques de diagnostic antigrippaux,
3. Suspension à 5 % d'érythrocytes de poulet.
4.
Saline.
La réaction est déposée sur le verre par la méthode de la goutte. 1 goutte de sérum de diagnostic et de matériel de test sont appliqués sur le verre, mélangés, puis 1 goutte de suspension d'érythrocytes est ajoutée. Avec une réaction positive, un rougissement homogène est observé, et avec une réaction négative, des flocons rouges apparaissent (hémagglutination).
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caractéristiques des virus de la grippe. Epidémiologie et diagnostic de la grippe. Utilisation du RTGA pour le sérotypage du virus de la grippe. Préparations pour la prophylaxie et le traitement spécifiques.
La grippe ou grippe est une maladie infectieuse aiguë caractérisée par des lésions des muqueuses des voies respiratoires supérieures, de la fièvre, une intoxication générale et une perturbation des systèmes cardiovasculaire et nerveux.
La grippe se caractérise par une tendance à la propagation épidémique et pandémique en raison de la forte contagiosité et de la variabilité de l'agent pathogène.
caractéristiques des agents pathogènes. Agents pathogènes - les virus de la grippe appartiennent à la famille. Orthomyxoviridae, genres Influenzavirus A, B et Influenzavirus C. Les virus de la grippe sont des virus à ARN. Le virus de la grippe de type A a été isolé en 1933 par W. Smith, K. Andrews, P. Laidlaw. En 1940 T.
Application de la méthode d'hémagglutination en virologie.
Francis et R. Medzhill ont isolé des virus grippaux de type B, en 1949 R. Taylor - type C. En Russie, les premiers virus grippaux ont été isolés en 1936 par A. A. Smorodintsev et attribués au type A. Morphologie. Les virus de la grippe ont une forme sphérique (forme de boule) - 80 - 120 nm, moins souvent ils ont une forme filamenteuse. Ils consistent en: 1) noyau - une nucléocapside de type hélicoïdal de symétrie (monocaténaire linéaire "-" -brin d'ARN + capside protéique); 2) membrane basale - membrane lipoprotéique externe - supercapside.
À la surface de la membrane, il existe des glycoprotéines (sous forme de pointes et de villosités) de 2 types: 1) hémagglutinine - favorise la fixation aux récepteurs cellulaires; 2) neuraminidase - favorise la libération du virus de la cellule. Cultivation. Pour la culture, des embryons de poulet, des cultures primaires de cellules trypsinisées et parfois des animaux de laboratoire sont utilisés.
Le modèle le plus pratique est celui des embryons de poulet âgés de 10 à 12 jours. Il vous permet d'obtenir de grandes quantités de virus, ce qui est nécessaire à la production de vaccins et de préparations bactériennes.
L'infection est réalisée dans la cavité allontoïque, sur la membrane chorion-allontoïque, dans la cavité amniotique, dans l'amnios. La présence du virus dans l'embryon de poulet est détectée par le test d'hémagglutination. Structure antigénique. Les virus ont un antigène interne - S et des antigènes de surface : HA-hémagglutinine et NA-neuraminidase. Antigène S - spécifique au groupe, commun à l'ensemble du type, selon cet antigène, les virus de la grippe sont divisés en types A, B et C. Il s'agit d'un antigène stable (immuable) fixant le complément.
Les antigènes HA et NA sont des antigènes spécifiques. L'antigène HA provoque la formation d'anticorps neutralisant le virus et l'agglutination des érythrocytes.
L'antigène NA provoque la formation d'anticorps qui neutralisent partiellement les virus.
Le virus de type B est moins variable, tandis que le type C est très stable.
propriétés toxiques. L'effet toxique du virus sur l'organisme (maux de tête, douleurs musculaires, fièvre, phénomènes catarrhaux) est dû aux protéines du virus (la particule virale elle-même). Cette action est strictement spécifique et n'est neutralisée que par le sérum immun du type ou sous-type correspondant ou par le sérum de ceux qui ont été malades. la résistance. Les virus de la grippe sont sensibles aux rayons UV, aux désinfectants (formol, alcool, phénol, chloramine) et aux solvants gras.
En milieu liquide, ils meurent à une température de 50 - 60°C pendant plusieurs minutes. A température ambiante dans l'air, les virus restent infectieux pendant plusieurs heures. Ils sont stockés longtemps sous forme séchée et à l'état congelé (-70 ° C), non seulement ils restent longtemps, mais ils ne perdent pas non plus leur virulence.
sensibilité animale. Dans des conditions naturelles, les virus de type A infectent les humains et les animaux (les chevaux et les porcs tombent malades), tandis que les virus de types B et C n'infectent que les humains. Parmi les animaux de laboratoire, les souris blanches, les furets africains, les hamsters syriens et les singes sont sensibles aux virus.
La maladie chez les animaux se caractérise par des lésions pulmonaires, de la fièvre et peut entraîner la mort des animaux. Épidémiologie de la maladie. La source d'infection est une personne malade présentant une forme cliniquement prononcée ou asymptomatique. Une personne malade libère le virus dans l'environnement en toussant, en parlant, en éternuant avec des gouttes de salive, de mucus, de crachats déjà en période d'incubation.
Le malade devient contagieux 24 heures avant l'apparition des principaux symptômes et présente un danger épidémique dans les 48 heures suivant leur disparition.
Le mécanisme de transmission est aérogène. La voie de transmission est aérienne. La susceptibilité humaine à la grippe est très élevée. Tous les groupes d'âge sont malades, principalement en hiver. Les enfants et les personnes âgées sont les plus sensibles. Le nom de la maladie reflète les caractéristiques de l'épidémiologie : la grippe des Français. pince - saisir, grippe - de l'italien. Influenza di freddo - l'influence du froid.
De toutes les maladies respiratoires aiguës, la grippe est la maladie la plus massive et la plus grave. Les pandémies et les épidémies de grippe couvrent jusqu'à 30 à 50 % ou plus de la population mondiale, causant d'énormes dommages à la santé et à l'économie des pays. Les premières descriptions d'épidémies de grippe remontent aux XIIe-XIVe siècles. L'apparition de pandémies et d'épidémies majeures est causée par le virus de la grippe de type A, qui est due à la grande variabilité du virus et est associée à l'émergence d'un nouveau sous-type à la suite d'un changement d'antigène.
Entre les pandémies, des flambées épidémiques se produisent tous les 1,5 à 2 ans, ce qui est associé à la dérive antigénique des virus. En 1918, la pandémie de grippe espagnole (1,5 milliard de personnes sont tombées malades, 20 millions de personnes en sont décédées) a été causée par le virus de la grippe A 1. Essentiellement enregistrée en Espagne, cette pandémie a touché la quasi-totalité de la population de la Terre ; la maladie se caractérisait par le développement d'une pneumonie hémorragique exceptionnellement sévère avec un taux de mortalité record (jusqu'à 1% de tous les cas).
En 1957, la pandémie "asiatique" (2 milliards de personnes sont tombées malades) a été causée par un nouveau sous-type - le sous-type A2. En 1968, la pandémie de "Hong Kong" (1 milliard de personnes sont tombées malades) a été causée par un sous-type nouvellement apparu - le sous-type A3. En règle générale, une nouvelle variante d'un virus remplace une variété antérieure en circulation dans la population humaine.
Mais en 1977, après une pause de 20 ans, le type A1 "est revenu" de manière inattendue, ce qui a conduit à une épidémie majeure. Par conséquent, les variantes réprimées du virus de la grippe persistent et, à certains intervalles, peuvent à nouveau provoquer une épidémie. Le virus de type B provoque des épidémies locales, tandis que le type C ne provoque pas d'épidémies. Pathogenèse et clinique de la maladie. La porte d'entrée est les voies respiratoires supérieures. Le virus envahit les cellules épithéliales de la muqueuse et s'y multiplie.
L'impact du virus sur les cellules épithéliales provoque leur nécrose et la desquamation (rejet) de l'épithélium, à la suite de quoi la membrane muqueuse devient perméable aux virus et aux bactéries. Ils pénètrent dans le sang et se propagent dans tout l'organisme. » La virémie s'accompagne de multiples lésions de l'endothélium capillaire avec une augmentation de leur perméabilité.
Dans les cas graves, il y a des hémorragies étendues dans les poumons, le myocarde, les organes parenchymateux. Les produits de désintégration des cellules endommagées et des protéines virales ont un effet toxique sur divers organes et systèmes d'organes. Les toxines du virus dépriment fortement le système nerveux central, et bien que le processus ne dure pas longtemps (3 à 5 jours), le malade reste longtemps affaibli et toute infection secondaire rejoint le corps affaibli et des complications surviennent : pneumonie grippale , œdème pulmonaire aigu, lésions rénales , cœur, bronches.
Une complication courante de la grippe est la pneumonie bactérienne (streptocoques du groupe B). Pendant la pandémie de grippe espagnole, les gens sont morts principalement de pneumonie bactérienne secondaire.
Dans la pathogenèse de la grippe, non seulement l'intoxication est importante, mais également l'allergisation, ainsi qu'une violation des propriétés fonctionnelles des cellules immunocompétentes avec le développement de l'immunodéficience. La période d'incubation est de plusieurs heures - 1-3 jours. Caractérisé par un début aigu, fièvre jusqu'à 37,5 - 38 ° C, intoxication générale, exprimée par des malaises, des maux de tête, des douleurs dans les globes oculaires, des processus inflammatoires des voies respiratoires de gravité variable (rhinite, laryngite, trachéite, pharyngite).
Un état fébrile avec grippe sans complication dure 5 à 6 jours. Immunité. Après la maladie, une immunité spécifique au type et à la souche se forme, qui est fournie par des facteurs cellulaires et humoraux spécifiques et non spécifiques. Les anticorps Ig A sont d'une grande importance.L'immunité croisée ne se développe pas, après avoir souffert de la grippe de type A1, vous pouvez attraper la grippe de type A2, etc. Après un virus de type immunité - 1-2 ans, après un virus de type B - 3-5 ans.
Immunité naturelle passive - chez les enfants jusqu'à 8 - 11 mois. En raison de la grande variabilité antigénique du virus, la guérison ne conduit pas au développement d'une immunité persistante à la réinfection.
Diagnostic de laboratoire. Matériel à l'étude: frottis-empreintes de la muqueuse nasale, écoulement nasopharyngé, morceaux de poumons, cerveau en cas d'issue létale.
Méthodes de diagnostic: 1) méthode de cytorhinoscopie - détection d'inclusions intracellulaires spécifiques du virus - lorsqu'elles sont colorées avec de la pyoctanine au microscope, des inclusions rouge vif du virus de la grippe sont visibles dans les cellules de l'épithélium ciliaire; 2) méthode virologique - isolement du virus de la grippe du corps humain en infectant des embryons de poulet avec un lavage du nasopharynx du patient; l'indication (présence) du virus est réalisée à l'aide de RGA (virus de la grippe agglutinant les érythrocytes humains et divers animaux), l'identification du virus est réalisée par étapes: le type est déterminé dans le RSC, le sous-type d'hémagglutinine est déterminé dans le RTGA, et le sous-type de neuraminidase est déterminé dans la réaction d'inhibition de l'activité enzymatique ; 3) méthode sérologique - détection d'une augmentation du titre (4 fois) d'anticorps spécifiques dans le sérum sanguin du patient en utilisant RSK, RTGA, PH en culture cellulaire, réaction de précipitation sur gel, ELISA ; 4) méthode biologique - infection intranasale de souris - introduction de matériel dans les poumons sous anesthésie à l'éther ; les souris meurent après 2 à 3 jours à la suite d'une pneumonie; 5) diagnostic express - détection de l'antigène viral à l'aide de RIF.
Traitement et prévention.
Pour la prévention et le traitement dans les premiers jours de la maladie, l'interféron leucocytaire humain est utilisé (par voie intranasale). À des fins thérapeutiques, des médicaments antiviraux sont utilisés - rimantadine (grippe de type A), adapromine, virazole et médicaments immunomodulateurs - dibazol, prodigiosan, lévomisole.
Dans la grippe sévère, en particulier chez les enfants, l'immunoglobuline antigrippale du donneur est utilisée, ainsi que des médicaments - inhibiteurs des protéases cellulaires (gordox, contrical, acide aminocaproïque).
Prévention spéciale. Les médicaments antiviraux et immunomodulateurs suivants sont utilisés, ainsi que les vaccins vivants et inactivés : 1) monovaccins vivants pour administration orale - souches atténuées de virus actuellement en circulation (A1, A3 et B) ; montrent la plus grande immunogénicité; 2) les vaccins à virions entiers issus de souches virulentes inactivées par le formaldéhyde ou les rayons UV ; 3) vaccins antigrippaux sous-unitaires uniquement à partir d'antigènes de surface - antigènes HA et NA (ont une réactogénicité minimale).
Pour obtenir des vaccins, les virus sont cultivés sur embryons de poulet et sur culture cellulaire d'embryons de poulet.
Avec l'introduction des vaccins, une immunité locale et humorale se forme. La vaccination est effectuée pendant les périodes de plus grand risque de développer des épidémies. Il est plus adapté aux jeunes et aux moins jeunes. L'utilisation de vaccins tués nécessite une revaccination annuelle ; leur efficacité ne dépasse pas 60-70%.
Car Étant donné que des variations antigéniques de l'agent pathogène sont souvent observées, l'ensemble d'antigènes du virus correspondant pour la vaccination ne peut être déterminé qu'après le début de l'épidémie.
Billet 15.
Réaction d'hémagglutination (RGA).
Au laboratoire, deux réactions d'hémagglutination différentes sont utilisées.
Le premier RGA fait référence à la sérologie. Dans cette réaction, les érythrocytes sont agglutinés lorsqu'ils interagissent avec les anticorps correspondants (hémagglutinines).
La réaction est largement utilisée pour déterminer les groupes sanguins.
La deuxième RHA n'est pas sérologique. Dans celui-ci, l'agglutination des érythrocytes est causée non
des anticorps, mais des substances spéciales formées par des virus. Par exemple, le virus de la grippe agglutine les érythrocytes des poulets et des cobayes, le virus de la poliomyélite agglutine les érythrocytes des moutons. Cette réaction permet de juger de la présence d'un virus particulier dans le matériel de test.
La réaction est effectuée dans des tubes à essai ou sur des plaques spéciales avec des puits.
Le matériel à tester pour la présence du virus est dilué avec une solution isotonique de 1:10 à 1:1280 ; 0,5 ml de chaque dilution est mélangé avec un volume égal de suspension d'érythrocytes à 1-2 %. Dans le contrôle, 0,5 ml d'érythrocytes sont mélangés avec 0,5 ml de solution isotonique. Les éprouvettes sont placées dans un thermostat pendant 30 minutes, et les plaques sont laissées à température ambiante pendant 45 minutes.
Comptabilisation des résultats. Avec un résultat positif de la réaction au fond du tube à essai ou du puits, un précipité d'érythrocytes aux bords festonnés ("parapluie") tombe, recouvrant tout le fond du puits.
Réaction d'inhibition de l'hémagglutination
Si le résultat est négatif, les érythrocytes forment un précipité dense aux bords lisses ("bouton"). Le même précipité devrait être sous contrôle.
L'intensité de la réaction est exprimée par des signes "+". Le titre du virus est la dilution maximale du matériel dans lequel se produit l'agglutination.
Réaction d'inhibition de l'hémagglutination
Il s'agit d'une réaction sérologique dans laquelle des anticorps antiviraux spécifiques, interagissant avec le virus (antigène), le neutralisent et le privent de la capacité d'agglutiner les globules rouges, c'est-à-dire
e. inhiber la réaction d'hémagglutination. Cette réaction vous permet de déterminer le type et le type de virus.
Réglage de la réaction. 0,25 ml de sérum antiviral est mélangé avec un volume égal de matériel contenant le virus. Le mélange est agité et placé dans un thermostat pendant 30 minutes, après quoi 0,5 ml de suspension d'érythrocytes à 1-2% est ajouté.
Comptabilisation des résultats. Avec le réglage correct de l'expérience dans le contrôle du sérum et des érythrocytes, un "bouton" devrait se former - il n'y a pas de facteur agglutinant les érythrocytes; dans le contrôle antigénique, un "parapluie" se forme - le virus provoque une agglutination des érythrocytes.
Si le sérum est homologue au virus étudié, un "bouton" se forme - le sérum a neutralisé le virus.
Réaction d'hémagglutination indirecte
La réaction d'hémagglutination indirecte (passive) (RIHA) est basée sur le fait que les érythrocytes, si un antigène soluble est adsorbé à leur surface, acquièrent la capacité de s'agglutiner lorsqu'ils interagissent avec des anticorps dirigés contre l'antigène adsorbé.
Réglage de la réaction.
Le sérum est chauffé pendant 30 minutes à 56 ° C, dilué séquentiellement dans un rapport de 1:10 - 1:1280 et versé dans des tubes à essai ou des puits de 0,25 ml, puis 2 gouttes d'érythrocytes avec des antigènes adsorbés dessus sont ajoutées.
Les contrôles: une suspension d'érythrocytes avec des antigènes adsorbés sur eux avec du sérum évidemment immun, une suspension d'érythrocytes avec des antigènes adsorbés sur eux avec du sérum normal; une suspension d'érythrocytes normaux avec le sérum testé.
Dans le premier contrôle, l'agglutination devrait se produire, dans les deuxième et troisième, elle ne devrait pas l'être.
Tester les questions.
1. Qu'est-ce qu'un résultat RGA positif entre les érythrocytes et le matériel testé pour la présence du virus indique ?
2. Une réaction d'agglutination des érythrocytes se produira-t-elle si un virus et son sérum correspondant leur sont ajoutés ?
Quel est le nom de la réaction qui révèle ce phénomène ?
TRAVAIL PRATIQUE №12.
Réaction de liaison du complément.
La réaction de liaison du complément (RCT) est basée sur le fait qu'un complexe antigène-anticorps spécifique adsorbe (se lie) toujours le complément sur lui-même.
Cette réaction est largement utilisée dans l'identification des antigènes et le sérodiagnostic des infections, en particulier des maladies causées par les spirochètes (réaction de Wassermann), les rickettsies et les virus.
Le PCS est une réaction sérologique complexe.
Il implique un complément et deux systèmes antigène-anticorps. Il s'agit essentiellement de deux réactions sérologiques.
Le système de base droit est constitué d'un antigène et d'un anticorps (l'un connu, l'autre non). Une certaine quantité de complément lui est ajoutée. Si l'antigène et l'anticorps de ce système correspondent, ils se connecteront et lieront un compliment. Le complexe résultant est finement dispersé et n'est pas visible.
La formation de ce complexe est connue à l'aide d'un second système hémolytique ou indicateur.
Il comprend les érythrocytes de mouton (antigène) et leur sérum hémolytique correspondant (anticorps), c'est-à-dire complexe immun prêt à l'emploi. Dans ce système, la lyse des érythrocytes ne peut se produire qu'en présence de complément. Si le complément est lié par le premier système, il n'y aura pas d'hémolyse dans le second système ;
pas de complément gratuit. L'absence d'hémolyse (le contenu du tube est trouble ou il y a un sédiment érythrocytaire au fond du tube) est enregistrée comme un résultat positif de RSK.
Si dans le premier système l'antigène ne correspond pas à l'anticorps, alors le complexe immun ne se forme pas et le complément restera libre. Restant libre, le compliment participe au deuxième système, provoquant une hémolyse, le résultat de RSK est négatif (le contenu des tubes est transparent - "sang de laque").
Composants, réactions de fixation du complément :
Antigène - généralement un lysat, un extrait, un haptène,
moins souvent une suspension de micro-organismes.
2. Anticorps - sérum du patient.
3. Complément - sérum de cobaye.
Antigène - érythrocytes de mouton.
5. Anticorps - hémolysine contre les érythrocytes de mouton.
6. Solution isotonique.
En raison du fait que le RSC implique un grand nombre de composants complexes,
ils doivent être pré-titrés et introduits dans la réaction en quantités exactes et en volumes égaux : 0,5 ou 0,25 ml, moins souvent 0,2, 1,25 ou 1,0 ml (des volumes plus importants donnent un résultat plus précis). Le titrage des composants de la réaction est effectué dans le même volume que l'expérience, en remplaçant les ingrédients manquants par une solution isotonique.
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Elle repose sur le fait que les érythrocytes, sur lesquels les antigènes sont pré-adsorbés, acquièrent la capacité de s'agglutiner en présence de sérums homologues (anticorps).
Dans ce cas, les érythrocytes jouent le rôle de porteurs de déterminants spécifiques, dont l'agglutination se produit à la suite de la réaction antigène + anticorps.
Les érythrocytes, à la surface desquels les antigènes sont solidement fixés, sont appelés diagnosticum antigénique érythrocytaire, ou érythrocytes sensibilisés par l'antigène.
Un autre type de RNHA - les anticorps sont adsorbés à la surface des érythrocytes et leur agglutination ultérieure se produit en présence d'un antigène homologue.
Dans ce cas, de tels érythrocytes sont appelés diagnostic d'anticorps érythrocytaires, ou érythrocytes sensibilisés par des anticorps.
Sur la base de ces deux approches méthodologiques fondamentales, de nombreuses modifications du RNGA ont été développées et sont utilisées. Ainsi, de petites particules standard de latex sont utilisées comme supports.
Réaction d'inhibition de l'hémagglutination (HITA)
Dans ce cas, la réaction est appelée réaction d'agglutination au latex (RLA) ou Staphylococcus aureus est utilisé - la réaction de coagglutination, etc. Habituellement, les diagnosticums érythrocytaires sont préparés dans des entreprises de l'industrie biologique et la principale expérience RNGA est déjà établie dans les laboratoires de diagnostic.
La préparation des diagnostics érythrocytaires comprend les étapes suivantes :
- fixation des érythrocytes avec du formaldéhyde ou des aldéhydes glutariques ou acryliques.
Ces érythrocytes traités sont stockés pendant une longue période. Le plus souvent, des érythrocytes de moutons, d'humains, de poulets, etc. sont utilisés à cette fin;
- traitement des érythrocytes fixés avec une solution de tanin. De ce fait, les érythrocytes acquièrent la propriété d'adsorber de manière irréversible les protéines (virus et anticorps) à leur surface ;
- sensibilisation des érythrocytes tanisés par des virus ou des anticorps.
Il convient de noter que les méthodes de préparation de diagnostics érythrocytaires pour les infections virales sont différentes.
La technique de mise en place de RNHA pour détecter et déterminer le titre d'anticorps est la suivante :
- à des dilutions consécutives de 2 fois de sérum ajouter des doses égales d'érythrocytes sensibilisés par l'antigène ;
- le mélange est laissé pendant 2-3 heures à température ambiante ou pendant 16-18 heures à 4°C ;
- prendre en compte les résultats.
Si le sérum contient des anticorps dirigés contre le virus avec lequel les érythrocytes ont été sensibilisés, une hémagglutination est observée, qui est évaluée en croisements.
Le titre d'anticorps sérique est considéré comme la dilution la plus élevée de sérum qui fournit encore une hémagglutination par au moins deux croisements.
Le RNGA est accompagné de tous les contrôles pertinents. Habituellement, ils mettent la réaction par la microméthode.
RNHA permet de résoudre les tâches de diagnostic suivantes :
- détecter les anticorps et déterminer leur titre dans le sérum sanguin à l'aide d'un diagnosticum antigénique érythrocytaire connu ;
- détecter et identifier un virus inconnu à l'aide d'un diagnostic d'anticorps érythrocytaire connu.
Avantages du RNGA : haute sensibilité, facilité de technique de réglage et réponse rapide.
Cependant, il est important de noter qu'il existe de grandes difficultés dans la préparation de diagnosticums érythrocytaires stables (grande dépendance à la pureté des composants utilisés, nécessité de sélectionner le mode de fixation, de tanisation et de sensibilisation des érythrocytes pour chaque type de virus) .
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Il utilise des érythrocytes ou des matériaux synthétiques neutres (par exemple, des particules de latex), à la surface desquels des antigènes (bactériens, viraux, tissulaires) ou des anticorps sont adsorbés.
Leur agglutination se produit lorsque les sérums ou antigènes appropriés sont ajoutés. Les globules rouges sensibilisés avec des antigènes sont appelés diagnosticum érythrocytaire antigénique et sont utilisés pour détecter et titrer les anticorps. Érythrocytes sensibilisés par des anticorps. sont appelés immunoglobulines diagnostiques érythrocytaires et sont utilisés pour détecter les antigènes.
La réaction d'hémagglutination passive est utilisée pour diagnostiquer des maladies causées par des bactéries (typhoïde et paratyphoïde, dysenterie, brucellose, peste, choléra, etc.), des protozoaires (paludisme) et des virus (grippe, infections à adénovirus, hépatite virale B, rougeole, virus transmis par les tiques). encéphalite, fièvre hémorragique de Crimée, etc.), ainsi que pour déterminer certaines hormones, pour identifier l'hypersensibilité du patient aux médicaments et aux hormones, comme la pénicilline et l'insuline.
La réaction d'hémagglutination passive (RPHA).
Le test d'hémagglutination passive est une méthode sensible de diagnostic sérologique et est utilisé à la fois pour le diagnostic précoce et rétrospectif, ainsi que pour déterminer l'état immunologique des personnes vaccinées. Chez les patients atteints de tularémie, les anticorps sont généralement détectés à la fin de la 1ère ou de la 2ème semaine de la maladie, après 1 à 1,5 mois, les titres de TPHA atteignent leurs valeurs maximales (1: 100 000-1: 20 000, moins souvent plus élevés), après quoi ils diminuent au niveau 1:100-1:200 persistent longtemps.
Chez les vaccinés, les anticorps sont également constamment détectés, cependant, à des titres inférieurs, ne dépassant pas 1:2000-1:5000 1-1,5 mois après la vaccination, ils restent pendant plusieurs années à un faible niveau de 1:20-1:80.
Le diagnosticum érythrocytaire de la tularémie (antigénique) sert d'antigène pour la mise en place du RPHA.
Le médicament est des érythrocytes de bélier formalinisés sensibilisés par l'antigène de la tularémie, disponible sous forme liquide et sèche. Préparation liquide - une suspension à 10% d'érythrocytes dans une solution de formol à 10% de concentration. Préparation sèche lyophilisée - suspension d'érythrocytes à 10% séchée sous vide sans conservateur. Avant utilisation, il est dilué selon les instructions sur l'étiquette. Pour la mise en place de la réaction dans des plaques de polystyrène, les deux préparations sont utilisées à une concentration de 2,5 %, et lors de la mise en place de la réaction en microvolumes, à une concentration de 0,5 %.
Technique de réglage RPGA.
Les sérums à tester sont dilués avec une solution saline 1:5 (1:10) et chauffés à 56 degrés C pendant 30 minutes.
Réaction d'hémagglutination (RHA) et
Après cela, afin d'éliminer les anticorps hétérogènes dirigés contre les érythrocytes de bélier, les sérums sont traités avec une suspension à 50 % d'érythrocytes de bélier formalisés. Pour ce faire, les érythrocytes sont ajoutés à raison de 2 gouttes (0,05 ml) pour 1 ml de sérum et soigneusement mélangés par agitation.
Le sérum est laissé jusqu'à la sédimentation complète des érythrocytes, ou centrifugé après une heure à température ambiante, après quoi il est prêt pour la recherche.
Le liquide de dilution est versé sous un volume de 0,5 ml dans plusieurs puits d'une plaque de polystyrène.
Dans une étude préalable des sérums, il convient de les tester en mettant en place la réaction dans une rangée courte de la plaque (6 trous). En cas de détection d'anticorps dans une courte série de sérums, les sérums sont réexaminés dans une longue série de dilutions (12 puits).
Après avoir renversé le liquide de dilution, 0,5 ml des sérums à tester dilués au 1:5 sont ajoutés au premier puits de chaque rangée (courte ou longue). Puis, dans les mêmes volumes, le sérum est titré avec des dilutions au 1/2. Ainsi, les dilutions de sérum sont obtenues dans une courte série de 1:10 à 1:320, et dans une longue série - de 1:10 à 1:20480. Après titrage des sérums, une goutte (0,05 ml) d'une suspension de travail à 2,5 % d'érythrocytes sensibilisés est ajoutée dans chaque puits.
Le contenu des plaques est bien agité jusqu'à l'obtention d'une suspension homogène. Les assiettes sont laissées à température ambiante sur une surface fixe de la table. L'enregistrement préliminaire de la réaction est effectué après 2-3 heures, la détermination finale du titre est effectuée après sédimentation complète des érythrocytes dans les puits. Les témoins suivants sont fournis pour la réaction : 1) sérum à tester à une dilution de 1:10 dans un volume de 0,5 ml + 1 goutte d'une suspension à 2,5 % d'érythrocytes non sensibilisés ; 2) un liquide de dilution dans un volume de 0,5 ml + 1 goutte d'une suspension à 2,5 % d'érythrocytes non sensibilisés ; 3) liquide de dilution dans un volume de 0,5 ml + 1 goutte d'une suspension à 2,5 % d'érythrocytes sensibilisés.
Tous les contrôles doivent donner une réaction clairement négative.
Comptabilité et évaluation de RPGA. La réaction est évaluée selon le schéma suivant :
1) une réaction fortement positive (++++) - les érythrocytes tombent au fond du puits en une couche uniforme sous la forme d'un "parapluie", qui a souvent des bords festonnés;
2) réaction positive (+++) - les érythrocytes recouvrent au moins les 2/3 du fond du trou ;
3) réaction faiblement positive (++) - l'agglutinat est petit et situé au centre même du trou;
4) réaction douteuse (+) - il y a des grains d'agglutinats séparés autour du sédiment érythrocytaire au centre même du trou;
5) négatif (-) - au fond du trou, les érythrocytes se déposent sous la forme d'un "bouton" ou d'un petit anneau aux bords lisses et bien définis.
Le titre sérique est pris en compte en fonction de la dernière dilution sérique, qui a donné une réaction très nette (au moins trois plus).
Une dilution de 1:100 et plus est considérée comme un titre diagnostique, cependant, comme dans le cas de la PR, il est nécessaire de surveiller son augmentation.
Le TPHA dans la tularémie est assez spécifique et ne détecte certaines réactions croisées qu'avec les sérums de brucellose. Le diagnostic différentiel est possible par la hauteur des titres en TPHA, qui sont beaucoup plus élevés avec un antigène homologue.
Technique de mise en place du RPHA en microvolumes.
La RPHA peut être réalisée en microvolumes à l'aide d'un microtitrage de type Takachi (ou de plaques de microtitration à fond rond avec des micropipettes), qui permet de titrer le matériau dans des volumes de 25 µl et 50 µl. La technique de mise en place des réactions, la séquence de toutes les opérations est la même que dans l'étude en plaques de polystyrène. Cependant, il convient de garder à l'esprit que la sensibilité de la méthode micro est généralement par dilution (c'est-à-dire
2 fois) inférieur à la macrométhode.
Pour mettre en place la réaction en microtitration à l'aide d'une pipette-compte-gouttes, du liquide de dilution est introduit dans chaque puits sous un volume de 50 µl. Puis, à l'aide de titrateurs à tête de 50 μl, le sérum à tester est prélevé en y plongeant la tête.
Assurez-vous que le liquide a rempli la tête du titrateur. Le titrateur avec sérum est transféré dans le premier puits et, en le maintenant en position verticale, effectue plusieurs mouvements de rotation dans les deux sens. Ensuite, le titrateur est transféré dans le puits suivant et la manipulation est répétée. Le titrage peut être effectué simultanément sur plusieurs rangées. Après titrage de toute la rangée, le titrateur est lavé à l'eau distillée (avec un changement de 2 portions) au moyen de mouvements de rotation, l'eau est retirée de la tête avec un écouvillon et brûlée sur une flamme de brûleur.
Après titrage, 25 μl d'erythrocyte diagnosticum sont ajoutés dans les puits.
La concentration du diagnosticum pour RPHA en microvolumes doit être de 0,5 % (c'est-à-dire qu'une suspension à 2,5 % d'érythrocytes est en outre diluée 5 fois). Après addition des érythrocytes, les plaques doivent être agitées doucement jusqu'à l'obtention d'une suspension homogène. Les résultats peuvent déjà être enregistrés après 1 à 1,5 heures, ce qui est un avantage significatif du RPHA dans un microtitrage.
De plus, cette méthode nécessite une petite quantité de tous les ingrédients de la réaction et des sérums à tester.
La réaction est comptabilisée comme suit :
1) "+" - hémagglutination complète, dans laquelle les érythrocytes tombent au fond du puits en une couche uniforme en forme de "parapluie", occupant au moins les 2/3 du fond;
2) "+ -" - hémagglutination partielle, dans laquelle les érythrocytes tombent au fond sous la forme d'un anneau lâche de petite taille;
3) "-" - l'absence d'hémagglutination, lorsque les érythrocytes tombent au fond sous la forme d'un petit bouton ou d'un anneau à bord lisse.
La spécificité d'un résultat positif obtenu en TPHA peut être testée à l'aide d'une réaction à trois composants - la réaction d'inhibition de l'hémagglutination passive (RPHA).
Technique de réglage RTPGA.
Cette réaction est réglée pour confirmer la spécificité d'un résultat positif de RPHA lorsqu'il est incertain ou présente un intérêt épidémiologique particulier. Le mécanisme réactionnel consiste en l'inhibition spécifique de l'hémagglutination lorsqu'une suspension de bactéries tularémiques tuées est ajoutée au sérum à tester. Trois composants interagissent dans la réaction : le sérum à tester, l'antigène spécifique de la tularémie et le diagnosticum érythrocytaire antigénique RTPGA sont généralement placés dans une rangée de 7 à 8 puits.
Il est conseillé d'installer un deuxième RPHA en parallèle avec RTPGA. 0,25 ml de liquide de dilution est versé dans deux rangées de puits, puis le sérum à tester sous un volume de 0,25 ml est ajouté dans les premiers puits des deux rangées et titré.2 rangées identiques de dilutions de sérum sont obtenues. Ajouter 0,25 ml de liquide de dilution dans tous les puits de la deuxième rangée et 0,25 ml de suspension de bactéries tularémiques dans les puits de la première rangée.
On utilise Tularemia diagnosticum (contenant 25 milliards de bactéries de la tularémie pour 1 ml), préalablement dilué 50 fois.
Une telle suspension contient 500 millions de bactéries dans 1 ml ou 125 millions dans un volume de 0,25 ml. Après avoir ajouté l'antigène, la plaque est laissée pendant 1 heure à température ambiante, après quoi une goutte (0,05 ml) d'érythrocyte diagnosticum est ajoutée à tous les puits des deux rangées, la plaque est secouée et laissée sur une surface plane de la table.
La comptabilité se fait en 2-3 heures.
Comptabilité et évaluation de RTPGA. Si le sérum à tester contient des anticorps spécifiques de la tularémie, ils sont neutralisés par l'antigène ajouté et l'hémagglutination ne se produira pas dans la première rangée de puits, ou, avec un titre sérique élevé, l'hémagglutination sera observée dans moins (2-4) puits que dans la ligne avec TPHA. Dans ce cas, la spécificité des résultats est confirmée.
Si une hémagglutination est notée dans les deux rangées, c'est-à-dire les résultats de RTHA et RPHA coïncident, cela indique l'absence d'anticorps anti-tularémie dans le sérum à tester. Dans ce cas, le résultat principal du RPHA est considéré comme non spécifique.
Technique de mise en RTPGA en microvolumes. La RTHA, ainsi que la RPHA, peuvent être réalisées en microvolumes à l'aide d'un microtitrage de type Takachi.
Pour ce faire, 0,25 µl de liquide de dilution sont ajoutés dans les puits de microplaques en deux rangées de 7-8 puits chacune. Ensuite, à l'aide d'un titrateur, 0,25 μl du sérum à tester est noté et titré dans les deux rangées. Après cela, 25 μl d'antigène de la tularémie (dont la concentration est de 500 millions de bactéries de la tularémie dans 1 ml) sont ajoutés dans chaque puits de la première rangée, et 25 μl de liquide de dilution dans la deuxième rangée.
Les plaques sont laissées 1 heure à température ambiante, puis 25 µl d'érythrocytes diagnostiques antigéniques (concentration 0,5 %) sont ajoutés dans tous les puits des deux rangées.
La comptabilisation et l'évaluation des résultats sont effectuées de la même manière que la réaction en macrovolumes.
Date de parution : 2015-02-03 ; Lire : 3176 | Violation des droits d'auteur de la page
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Un test sanguin bien mené aide à détecter les agents pathogènes de diverses maladies complexes dans le corps aux premiers stades de leur développement, et parfois même avant l'apparition des symptômes cliniques de la maladie. Très souvent, les médecins prescrivent aux patients une analyse pour une réaction d'agglutination. Ensuite, nous aborderons le fait qu'il s'agit d'un test sanguin RPHA, quand est-il utilisé et que peut-il dire ?
Principe de fonctionnement
La réaction d'hémagglutination indirecte (également appelée réaction d'hémagglutination passive, également connue sous le nom de RPHA, RNHA) se produit lorsque les érythrocytes adsorbant l'antigène sont exposés au sérum immun correspondant à cet antigène.
Des études ont montré que cette méthode est nettement supérieure aux autres tests sérologiques en termes de spécificité et de sensibilité. Par conséquent, il est souvent utilisé pour détecter les maladies causées par des bactéries ou des rickettsies. Des extraits bactériens, des antigènes purifiés de divers microbes, des composants de vaccins bactériens peuvent servir d'antigènes pour une telle analyse.
Après qu'une bactérie pathogène pénètre dans le corps humain, des anticorps spécifiques et non spécifiques commencent à y être produits, formant une certaine réponse immunitaire. Dans le cas de la syphilis, qui serait causée par le tréponème pallidum, un spirochète à Gram négatif, des anticorps non tréponémiques ou tréponémiques sont produits dans le sang humain. Les études de diagnostic en laboratoire sont basées sur leur détection, qui devrait confirmer ou réfuter la présence de l'agent causal du virus dans le corps.
Avec RPHA, les érythrocytes, dont la surface a adsorbé des antigènes de tréponème pâle, dans le cas de l'ajout de sérum avec des anticorps contre le tréponème à partir du matériel d'une personne infectée par la syphilis, se collent, c'est-à-dire que leur agglutination se produit.
Fiabilité de l'étude
Il est important de se rappeler que les anticorps dirigés contre le spirochète pallidum commencent à apparaître dans le corps des personnes infectées 2 à 4 semaines après l'infection et, dans certains cas, cette période peut être prolongée jusqu'à 6 semaines.
Pour cette raison, la sensibilité de l'analyse de RPHA au stade primaire du développement de la maladie est d'environ 86%, ce qui est nettement inférieur à la précision du diagnostic des patients aux deux stades suivants. La sensibilité de l'analyse pour ces patients, ainsi que pour les porteurs de syphilis latente, atteint 99-100%.
Cependant, la réaction d'hémagglutination passive a une spécificité très élevée, qui atteint le niveau de 96-100%.
Cela permet d'utiliser cet examen pour confirmer le diagnostic en cas de réaction positive d'une étude préliminaire non tréponémique, par exemple la réaction de microprécipitation du cancer de la vessie.
Étant donné que la sensibilité des tests tréponémiques, y compris le TPHA, dépasse de manière significative la sensibilité des méthodes non tréponémiques, ces tests sont de plus en plus prescrits pour les tests de dépistage de la syphilis. Cependant, lorsqu'une réaction de dépistage positive est obtenue, une autre analyse spécifique (tréponémique) est nécessaire pour clarifier le diagnostic, mais pas le TPHA.
Décryptage de l'analyse
Lorsque du sérum contenant des anticorps contre le tréponème provenant du matériel d'une personne infectée par la syphilis est ajouté au réactif avec lequel l'étude est réalisée, une agglutination des érythrocytes se produit, à la suite de laquelle ils précipitent.
Le nombre d'érythrocytes adhérents est affecté par le niveau d'anticorps dans le sérum. Par conséquent, l'hémagglutination passive montre non seulement la présence d'anticorps, mais vous permet également de définir leur nombre. Le résultat de l'étude est représenté par le niveau de titre d'anticorps.
Une réaction positive indique la présence de l'agent pathogène dans le corps du patient. Cependant, au cours du processus de diagnostic, des réactions faussement positives peuvent survenir, dont le nombre ne dépasse pas statistiquement le niveau de 0,05 à 2,5% du nombre total d'études.
Une réaction positive du TPHA chez les personnes qui ne sont pas infectées par la syphilis peut se produire s'il y a :
- maladies systémiques du tissu conjonctif,
- dans le sang du patient, des anticorps dirigés contre des agents pathogènes similaires au tréponème pâle,
- pathologies physiologiques, telles que l'infarctus du myocarde,
- hépatite B ou C
- maladies oncologiques,
- typhoïde, leptospirose, tuberculose,
- Infection par le VIH
- borréliose étiologie transmise par les tiques,
- blessures graves ou fractures,
- grossesse,
- en cas d'injection de drogue.
Dans la plupart des cas, les réactions faussement positives s'accompagnent d'un titre faible. Des titres élevés sont typiques du stade secondaire de la maladie et de la syphilis précédemment latente. Cependant, ils peuvent également apparaître avec une réaction faussement positive chez les patients atteints de néoplasmes malins.
Chez les personnes qui ont eu la syphilis au moins une fois, la réaction du RPHA reste positive jusqu'à la fin de leur vie.
De rares exceptions sont les situations où la maladie a été détectée à un stade précoce de développement, après quoi une thérapie intensive et efficace a été effectuée. Par conséquent, l'analyse du TPHA ne peut pas être utilisée pour évaluer la dynamique de récupération ou le diagnostic comparatif des stades précoces ou tardifs de la maladie.
Dès réception d'une réaction positive, il est nécessaire d'examiner les membres de la famille du malade et les personnes qui ont eu des contacts sexuels avec lui.
Une réaction négative peut être obtenue dans les cas suivants :
- la personne n'a pas la syphilis,
- du sang mal prélevé pour la recherche,
- 2 à 4 semaines se sont écoulées depuis l'infection et la production d'anticorps n'a pas encore commencé.
Dans tous les cas, le résultat de l'étude doit être évalué en combinaison avec des indicateurs de laboratoire et anamnestiques supplémentaires.
A qui est montrée l'analyse ?
Le médecin peut diriger le don de sang pour les patients RPHA dans les cas suivants :
- en présence de manifestations cliniques de la syphilis: éruptions cutanées ulcéreuses, ganglions lymphatiques hypertrophiés, alopécie diffuse et autres,
- si vous suspectez une éventuelle infection en cas de contact avec des personnes déjà malades,
- donneurs désireux de donner leur sang,
- les personnes qui subissent des examens préventifs annuels ou qui établissent des carnets sanitaires,
- les patients avec un test de dépistage positif,
- avant l'admission à l'hôpital,
- lors de l'examen préopératoire
- pour la détection des agents pathogènes de la salmonellose, de la diphtérie, de la dysenterie par la méthode de conduite de RPHA avec le diagnosticum approprié.
Procédure de recherche
Un échantillon de sang veineux soumis par le patient est envoyé pour examen. Afin de ne pas obtenir une conclusion erronée, le patient doit être responsable de la préparation de l'analyse. Pour que les résultats des tests soient fiables, les recommandations suivantes doivent être suivies :
- L'analyse doit être effectuée uniquement à jeun.
- Le jour de l'analyse, vous pouvez boire de l'eau minérale sans gaz en quantité minimale.
- Vous ne devez pas fumer pendant au moins 30 minutes avant le test, mais il est préférable d'augmenter ce temps à plusieurs heures.
- Une interdiction directe est imposée sur la consommation de boissons alcoolisées.
- Les patients qui doivent utiliser régulièrement des médicaments doivent absolument en informer le médecin traitant.
- Si vous ne vous sentez pas bien ou si vous ne vous sentez pas bien, vous devez en informer l'infirmière qui prélève l'échantillon de sang ou le médecin de la clinique externe où vous devez passer le test.
Soyez responsable non seulement de la question de savoir où passer le test, mais également de la préparation à l'examen.
Diagnostic d'autres maladies infectieuses
Il ne faut pas penser qu'une étude telle que RPGA ne peut être réalisée que pour identifier l'agent causal de la syphilis dans le corps.
Une analyse avec un diagnostic de salmonelle vous permet d'identifier la présence d'une infection dans le système digestif - la salmonelle. À partir du quatrième jour après l'infection, le corps produit des anticorps contre les antigènes de Salmonella, qui peuvent être détectés par la méthode RPGA. Un résultat négatif indique l'absence d'infection, et un titre positif, passant de 1:200 à 1:800 en phase aiguë, indiquera sa présence.
La méthode de réalisation de RPHA avec un marqueur diphtérique permet de diagnostiquer la diphtérie et d'évaluer l'immunité après la vaccination. Les anticorps commencent à être produits par le système immunitaire dès le lendemain de l'infection et restent dans le corps pendant plusieurs semaines. La sensibilité de cette analyse dépasse la méthode de recherche bactériologique. Le titre 1:80 confirme la présence de diphtérie dans le corps.
Le marqueur de la dysenterie dans RPHA détecte le plus précisément la shigellose (dysenterie bacillaire), même par rapport à la méthode de diagnostic en laboratoire par culture bactérienne. Si le patient ne reçoit pas de traitement de haute qualité, la maladie se transforme alors en un processus chronique, dans lequel des rechutes se produisent souvent. L'analyse permet de diagnostiquer la phase aiguë et chronique de la diarrhée, d'identifier l'agent causal de la dysenterie, de distinguer la shigellose bactérienne du cancer colorectal, des troubles endocriniens ou de l'inflammation du côlon. Une réaction négative indique l'absence d'un bacille, et confirme sa présence avec un titre de 1:80 pour les bébés ou 1:320 pour les adultes.
Mener une étude avec un marqueur de la rougeole vous permet de déterminer la maladie avec la rougeole. Un tel examen peut être une alternative à l'analyse IH souvent effectuée pour le diagnostic de la rougeole.
Alors, test sanguin RPHA - qu'est-ce que c'est? En résumé, nous pouvons dire en toute sécurité qu'il s'agit d'une méthode moderne, très sensible et fiable pour diagnostiquer diverses maladies d'étiologie bactériologique.
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Réaction d'inhibition de l'hémagglutination
Réaction d'hémagglutination
Réaction d'agglutination
La réaction d'agglutination (RA) est l'agglutination et la précipitation de microbes ou d'autres cellules sous l'action d'anticorps en présence d'un électrolyte (solution isotonique de chlorure de sodium). Le précipité obtenu est appelé agglutiner.
Pour la réaction dont vous avez besoin:
1. Anticorps (agglutinines) - se trouvent dans le sérum du patient ou dans le sérum immunitaire.
2. Antigène - une suspension de micro-organismes vivants ou tués, d'érythrocytes ou d'autres cellules.
3. Solution isotonique.
La réaction d'agglutination pour le sérodiagnostic est largement utilisée pour la fièvre typhoïde, la fièvre paratyphoïde (réaction de Vidal), la brucellose (réaction de Wright), etc. L'anticorps est le sérum du patient et l'antigène est un microbe connu.
Lorsque des microbes ou d'autres cellules sont identifiés, leur suspension sert d'antigène et un sérum immun connu sert d'anticorps. Cette réaction est largement utilisée dans le diagnostic des infections intestinales, de la coqueluche, etc.
En pratique de laboratoire, deux réactions d'hémagglutination (RHA) sont utilisées, qui sont différentes dans leur mécanisme d'action.
Premier RGA fait référence à la sérologie. Dans cette réaction, les érythrocytes sont agglutinés lorsqu'ils interagissent avec les anticorps correspondants (hémagglutinines). La réaction est largement utilisée pour déterminer les groupes sanguins.
Deuxième RGA n'est pas sérologique. Dans celui-ci, le collage des globules rouges n'est pas causé par des anticorps, mais par des substances spéciales formées par des virus. Par exemple, le virus de la grippe agglutine les érythrocytes des poulets et des cobayes, le virus de la poliomyélite agglutine les érythrocytes des moutons. Cette réaction permet de juger de la présence d'un virus particulier dans le matériel de test.
Il s'agit d'une réaction sérologique dans laquelle des anticorps antiviraux spécifiques, interagissant avec le virus (antigène), le neutralisent et le privent de la capacité d'agglutiner les globules rouges, c'est-à-dire d'inhiber la réaction d'hémagglutination. La haute spécificité de la réaction d'inhibition de l'hémagglutination (HITA) permet de l'utiliser pour déterminer le type voire le type de virus détectés lors de l'HA.
La réaction d'hémagglutination indirecte (passive) (RIHA) est basée sur le fait que les érythrocytes, si un antigène soluble est adsorbé à leur surface, acquièrent la capacité de s'agglutiner lorsqu'ils interagissent avec des anticorps dirigés contre l'antigène adsorbé. Le schéma RNGA est illustré à la fig. RNHA est largement utilisé dans le diagnostic d'un certain nombre d'infections.
Riz. Schéma de la réaction d'hémagglutination passive (RPHA). A - obtention d'un diagnosticum érythrocytaire ; B - RNGA : 1-érythrocyte : 2 - l'antigène étudié ; 3 - diagnostic érythrocytaire; 4 - anticorps dirigé contre l'antigène étudié : 5 - agglutiné.
Avec l'aide du RNHA, un antigène inconnu peut être déterminé si des anticorps connus sont adsorbés sur les érythrocytes.