Iekļauts medikamentos
Iekļauts sarakstā (Krievijas Federācijas valdības dekrēts Nr. 2782-r, datēts ar 2014. gada 30. decembri):VED
ONLS
ATH:L.03.A.B.05 Interferons alfa-2b
Farmakodinamika:Interferons. Tas ir ļoti attīrīts rekombinants, kura molekulmasa ir 19 300 daltoni. Atvasināts no klona Escherichia coli hibridizējot baktēriju plazmīdas ar cilvēka leikocītu gēnu, kas kodē interferona sintēzi. Atšķirībā no interferona alfa-2a atrodas 23. pozīcijā.
Tam ir pretvīrusu iedarbība, ko izraisa mijiedarbība ar specifiskiem membrānas receptoriem un RNS sintēzes indukcija un, visbeidzot, olbaltumvielas. Pēdējie savukārt novērš normālu vīrusa vairošanos vai tā izdalīšanos.
Tam ir imūnmodulējoša aktivitāte, kas saistīta ar fagocitozes aktivizēšanu, antivielu un limfokīnu veidošanās stimulāciju.
Tam ir antiproliferatīva iedarbība uz audzēja šūnām.
Zāles palielina makrofāgu fagocītisko aktivitāti, pastiprina limfocītu citotoksisko iedarbību.
Farmakokinētika:Tas iekļūst sistēmiskajā cirkulācijā caur elpceļu gļotādu, organismā sabrūk un daļēji izdalās nemainītā veidā, galvenokārt caur nierēm. Vietējā lietošana vīrusu infekciju ārstēšanai nodrošina augstu interferona koncentrāciju iekaisuma fokusā. Tas tiek metabolizēts aknās, pusperiods ir 2-6 stundas.
Indikācijas:hronisks hepatīts
B;matains šūnu leikēmija;
Nieru šūnu karcinoma;
Ādas T -šūnu limfoma (mycosis fungoides un Cesari sindroms);
AT vīrusu B hepatīts;
AT vīrusu aktīvs C hepatīts;
Hroniska mieloleikoze;
Kapoši sarkoma uz AIDS fona;
ļaundabīga melanoma;
- primārā (esenciālā) un sekundārā trombocitoze;
- hroniskas granulocītu leikēmijas un mielofibrozes pārejas forma;
- multiplā mieloma;
nieru vēzis;
- retikulosarkoma;
- multiplā skleroze;
- gripas un akūtu elpceļu vīrusu infekciju profilakse un ārstēšana.
I.B15-B19.B16 Akūts B hepatīts
I.B15-B19.B18.1 Hronisks vīrusu hepatīts B bez delta izraisītāja
I.B15-B19.B18.2 Hronisks vīrusu hepatīts C
I.B20-B24.B21.0 HIV slimība ar Kapoši sarkomas izpausmēm
II.C43-C44.C43.9 Ļaundabīga ādas melanoma, neprecizēta
II.C64-C68.C64 Nieru ļaundabīgs audzējs, izņemot nieru iegurni
II.C81-C96.C84 Perifērās un ādas T-šūnu limfomas
II.C81-C96.C84.0 Sēnīšu mikoze
II.C81-C96.C84.1 Cēzara slimība
II.C81-C96.C91.4 Matšūnu leikēmija (leikēmiskā retikuloendotelioze)
II.C81-C96.C92.1 Hroniska mieloleikoze
Kontrindikācijas:D nekompensēta aknu ciroze;
Psihoze;
P paaugstināta jutība pret alfa-2 interferonu b;
- smagas sirds un asinsvadu slimības;
T Es novēlu depresiju;
BET alkohola vai narkotiku atkarība;
- autoimūnas slimības;
- akūts miokarda infarkts;
- smagi hematopoētiskās sistēmas traucējumi;
-epilepsija un/vai citi centrālās nervu sistēmas traucējumi;
-hronisks hepatīts pacientiem, kuri saņem imūnsupresīvu terapiju vai īsi pirms tās saņemšanas (izņemot īslaicīgu iepriekšēju ārstēšanu ar steroīdiem).
Uzmanīgi:-aknu slimība;
W nieru slimība;
-kaulu smadzeņu hematopoēzes pārkāpums;
-uzņēmība pret autoimūnām slimībām;
-nosliece uz pašnāvības mēģinājumiem.
Grūtniecība un laktācija:FDA C kategorijas ieteikums Nav pieejami drošības dati. Nepieteikties! Lietošana grūtniecības laikā ir iespējama tikai tad, ja iespējamais ieguvums mātei pārsniedz iespējamo kaitējumu bērnam.
Zāļu lietošanas laikā jāizmanto kontracepcijas metodes.
Nav informācijas par iekļūšanu mātes pienā. Nelietot zīdīšanas laikā.
Devas un ievadīšana:Ievadiet intravenozi vai subkutāni. Deva tiek noteikta individuāli atkarībā no diagnozes un pacienta individuālajiem rādītājiem.
Subkutāna injekcija devā 0,5-1 mkg/kg reizi nedēļā 6 mēnešus. Deva tiek izvēlēta, ņemot vērā paredzamo efektivitāti un drošību. Ja pēc 6 mēnešiem vīrusa RNS izdalās no seruma, tad ārstēšanu turpina līdz vienam gadam. Ja ārstēšanas laikā rodas nevēlamas reakcijas, devu samazina 2 reizes. Ja nevēlamās blakusparādības saglabājas vai atkal parādās pēc devas maiņas, ārstēšana tiek pārtraukta. Devu ieteicams samazināt arī tad, ja neitrofilo leikocītu skaits ir mazāks par 0,75×10 9 /l vai trombocītu skaits ir mazāks par 50×10 9 /l. Terapija tiek pārtraukta, ja neitrofilu skaits ir mazāks par 0,5 × 10 9 /l vai trombocītu skaits - mazāks par 25 × 10 9 /l. Smagu nieru darbības traucējumu gadījumā (klīrenss mazāks par 50 ml/min), pacientiem jābūt pastāvīgā uzraudzībā. Ja nepieciešams, zāļu nedēļas devu samazina. Devas maiņa atkarībā no vecuma nav nepieciešama.
Šķīduma pagatavošana: flakona pulverveida saturu izšķīdina 0,7 ml ūdens injekcijām, flakonu viegli sakrata, līdz pulveris ir pilnībā izšķīdis. Gatavais šķīdums pirms ievadīšanas ir jāpārbauda; krāsas maiņas gadījumā to nevajadzētu lietot. Ievadīšanai izmanto līdz 0,5 ml šķīduma, atlikumus iznīcina.
Gripas un SARS ārstēšanai
- aerosols lokālai lietošanai 100 000 ME, ievada 7 reizes dienā, ik pēc 2 stundām (dienas deva - līdz 20 000 ME) pirmajās divās slimības dienās, pēc tam 3 reizes dienā (dienas deva - līdz 10 000 ME) laikā piecas dienas vai līdz simptomi pilnībā izzūd.Interferona terapija tiek veikta uz tradicionālās simptomātiskās terapijas fona, ieskaitot nesteroīdos pretiekaisuma līdzekļus (,) ar temperatūras paaugstināšanos virs 38,5 ° C, antihistamīna līdzekļus (diazolīnu, suprastīnu, tavegilu), pretklepus līdzekļus (kodelaku). , mukolītiskie līdzekļi (klepus maisījums,) , stiprinoši līdzekļi (kalcija glikonāts, vitamīni).
Blakus efekti:No kuņģa-zarnu trakta: samazināta ēstgriba, vemšana, aizcietējums, sausa mute, vieglas sāpes vēderā, slikta dūša, caureja,
garšas sajūtas pārkāpums, svara zudums, nelielas izmaiņas aknu darbības pārbaudēs.No nervu sistēmas: reibonis, miega traucējumi, trauksme, agresivitāte, depresija, neiropātija, pašnāvības tendences, garīga pasliktināšanās,
atmiņas traucējumi, nervozitāte, eiforija, parestēzija, trīce, miegainība.No asinsrites sistēmas: arteriāla hipotensija vai hipertensija, sirds un asinsvadu sistēmas traucējumi, miokarda infarkts, trombocitopēnija, tahikardija,
aritmija, išēmiska sirds slimība, leikopēnija, granulocitopēnija.No elpošanas sistēmas: klepus, pneimonija, sāpes krūtīs,
neliels elpas trūkums, plaušu tūska.No ādas puses: atgriezeniska alopēcija, nieze.
Citi: antivielas pret dabīgiem vai rekombinantiem interferoniem, muskuļu stīvums, gripai līdzīgi simptomi.
Pārdozēšana:Nav datu.
Mijiedarbība:Zāles inhibē teofilīna metabolismu.
Speciālas instrukcijas:Zāļu lietošanas laikā ir nepieciešams uzraudzīt pacienta garīgo un neiroloģisko stāvokli.
Pacientiem ar sirds un asinsvadu sistēmas slimībām ir iespējama aritmija. Ja aritmija nesamazinās vai palielinās, deva jāsamazina 2 reizes vai ārstēšana jāpārtrauc.
Ar nopietnu kaulu smadzeņu hematopoēzes kavēšanu ir nepieciešams regulārs perifēro asiņu sastāva pētījums.
Ietekme uz spēju vadīt transportlīdzekļus un citas tehniskas ierīces
Zāles aerosola veidā neietekmē spēju vadīt transportlīdzekļus un uzturēt kustīgus mehānismus.
InstrukcijasInterferona preparātu sastāvs ir atkarīgs no to izdalīšanās formas.
Atbrīvošanas forma
Interferona preparātiem ir šādas izdalīšanās formas:
- liofilizēts pulveris acu un deguna pilienu pagatavošanai, injekciju šķīdums;
- injekcijas šķīdums;
- acu pilieni;
- Acu plēves;
- deguna pilieni un aerosols;
- ziede;
- dermatoloģiskais gēls;
- liposomas;
- smidzināšanas kanna;
- šķīdums iekšķīgai lietošanai;
- taisnās zarnas svecītes;
- maksts svecītes;
- implanti;
- mikroklisteri;
- tabletes (tabletēs interferonu ražo ar zīmolu Entalferon).
farmakoloģiskā iedarbība
IFN preparāti pieder pretvīrusu un imūnmodulējošu zāļu grupai.
Visiem IFN ir pretvīrusu un pretvēža aktivitāte. Tikpat svarīga ir viņu spēja stimulēt darbību. makrofāgi - šūnas, kurām ir svarīga loma iniciācijā.
IFN veicina organisma pretestības palielināšanos pret iespiešanos vīrusi un bloķēt reprodukciju vīrusi kad viņi nonāk šūnā. Pēdējais ir saistīts ar IFN spēju nomākt vīrusa sūtņa RNS tulkošana .
Tajā pašā laikā IFN pretvīrusu iedarbība nav vērsta pret noteiktiem vīrusi , tas ir, IFN nav raksturīga vīrusa specifika. Tas izskaidro to daudzpusību un plašo pretvīrusu aktivitātes klāstu.
Interferons - kas tas ir?
Interferoni ir klase ar līdzīgām īpašībām glikoproteīni , ko ražo mugurkaulnieku šūnas, reaģējot uz dažādu veidu induktoriem, gan vīrusu, gan nevīrusu raksturu.
Saskaņā ar Vikipēdiju, lai bioloģiski aktīvo vielu varētu kvalificēt kā interferonu, tai jābūt proteīna rakstura, tai jābūt izteiktai pretvīrusu aktivitāte saistībā ar dažādiem vīrusi , vismaz homologās (līdzīgās) šūnās, "ko veic šūnu vielmaiņas procesi, tostarp RNS un olbaltumvielu sintēze".
PVO un Interferona komitejas ierosinātā IFN klasifikācija ir balstīta uz atšķirībām to antigēnajās, fizikālajās, ķīmiskajās un bioloģiskajās īpašībās. Turklāt tiek ņemta vērā to suga un šūnu izcelsme.
Saskaņā ar antigenitāti (antigēnu specifiskumu) IFN parasti iedala skābju izturīgā un skābju labilā. Alfa un beta interferoni (saukti arī par I tipa IFN) ir skābju izturīgi. Gamma interferons (γ-IFN) ir skābju labils.
α-IFN produkcija perifēro asiņu leikocīti (B un T tipa leikocīti), tāpēc tas iepriekš tika apzīmēts kā leikocītu interferons . Pašlaik ir vismaz 14 tās šķirnes.
Tiek ražots β-IFN fibroblasti , tāpēc to sauc arī fibroblastisks .
Iepriekšējais apzīmējums γ-IFN - imūnais interferons , bet tā stimulēta T veida limfocīti , NK šūnas (normālie (dabiskie) slepkavas; no angļu valodas “natural killer”) un (domājams) makrofāgi .
IFN galvenās īpašības un darbības mehānisms
Bez izņēmuma visiem IFN ir raksturīga polifunkcionāla aktivitāte pret mērķa šūnām. Viņu visizplatītākā īpašība ir spēja tajos pamudināt pretvīrusu stāvoklis .
Interferonu izmanto kā terapeitisku un profilaktisku līdzekli dažādiem vīrusu infekcijas . IFN preparātu iezīme ir tā, ka to iedarbība vājina atkārtotas injekcijas.
IFN darbības mehānisms ir saistīts ar tā spēju inhibēt vīrusu infekcijas . Ārstēšanas rezultātā ar interferona zālēm pacienta organismā ap infekcijas fokuss sava veida barjera veidojas no izturīgas pret vīruss neinficētas šūnas, kas novērš tālāku infekcijas izplatīšanos.
Mijiedarbojoties ar vēl neskartām (neskartām) šūnām, tas novērš reproduktīvā cikla īstenošanu vīrusi aktivizējot noteiktus šūnu enzīmus ( proteīna kināzes ).
Interferonu vissvarīgākā funkcija ir spēja nomākt hematopoēze ; modulēt organisma imūnreakciju un iekaisuma reakciju; regulē šūnu proliferācijas un diferenciācijas procesus; kavē augšanu un novērš reprodukciju vīrusu šūnas ; stimulē virsmas izteiksmi antigēni ; nomāc atsevišķas funkcijas B un T tipa leikocīti aktivitātes stimulēšanai NK šūnas utt.
IFN izmantošana biotehnoloģijā
Sintēzes un augstas veiktspējas attīrīšanas metožu izstrāde leikocīti un rekombinantie interferoni zāļu ražošanai pietiekamā daudzumā, ļāva pavērt iespēju lietot IFN preparātus, lai ārstētu pacientus, kuriem diagnosticēts vīrusu hepatīts .
Rekombinanto IFN atšķirīgā iezīme ir tā, ka tie tiek ražoti ārpus cilvēka ķermeņa.
Piemēram, rekombinantais interferons beta-1a (IFN β-1a) iegūts no zīdītāju šūnām (jo īpaši no Ķīnas kāmja olnīcu šūnām) un pēc īpašībām līdzīgas interferons beta-1b (IFN β-1b) ko ražo Enterobacteriaceae dzimtas pārstāvis coli (Escherichia coli).
Interferonu inducējošas zāles - kas tas ir?
IFN induktori ir zāles, kas pašas nesatur interferonu, bet tajā pašā laikā stimulē tā ražošanu.
Farmakodinamika un farmakokinētika
α-IFN galvenā bioloģiskā iedarbība ir vīrusu proteīnu sintēzes kavēšana . Šūnas pretvīrusu stāvoklis attīstās dažu stundu laikā pēc zāļu lietošanas vai IFN ražošanas ierosināšanas organismā.
Tajā pašā laikā IFN neietekmē agrīnās stadijas replikācijas cikls, tas ir, adsorbcijas, iespiešanās stadijā vīruss šūnā (iekļūšana) un iekšējā komponenta atbrīvošanās vīruss viņa izģērbšanas procesā.
Pretvīrusu darbība α-IFN izpaužas pat šūnu infekcijas gadījumā infekciozā RNS . IFN neietilpst šūnā, bet tikai mijiedarbojas ar specifiskiem receptoriem šūnu membrānas (gangliozīdi vai līdzīgas struktūras, kas satur oligocukurs ).
IFN alfa darbības mehānisms atgādina indivīda darbību glikopeptīdu hormoni . Tas stimulē aktivitāti gēni , no kuriem daži ir iesaistīti produktu veidošanās kodēšanā ar tiešo pretvīrusu darbība .
β interferoni arī ir pretvīrusu darbība , kas ir saistīts ar vairākiem darbības mehānismiem vienlaikus. Beta interferons aktivizē NO-sintetāzi, kas savukārt palielina slāpekļa oksīda koncentrāciju šūnas iekšienē. Pēdējam ir galvenā loma reprodukcijas nomākšanā vīrusi .
β-IFN aktivizē sekundārās, efektora funkcijas dabiskie slepkavasiekšā , B tipa limfocīti , asins monocīti , audu makrofāgi (mononukleārie fagocīti) un neitrofīls , kam raksturīga no antivielām atkarīga un no antivielām neatkarīga citotoksicitāte.
Turklāt β-IFN bloķē iekšējā komponenta izdalīšanos vīruss un izjauc metilēšanas procesus vīrusa RNS .
γ-IFN ir iesaistīts imūnās atbildes regulēšanā un regulē smagumu iekaisuma reakcijas. Lai gan viņam ir savs pretvīrusu un pretvēža iedarbība , gamma interferons ļoti vāja. Tajā pašā laikā tas ievērojami uzlabo α- un β-IFN aktivitāti.
Pēc parenterālas ievadīšanas maksimālā IFN koncentrācija in tiek novērota pēc 3-12 stundām Biopieejamības indekss ir 100% (gan pēc injekcijas zem ādas, gan pēc injekcijas muskulī).
Pusperioda ilgums T½ ir no 2 līdz 7 stundām. IFN neliela koncentrācija plazmā netiek noteikta pēc 16-24 stundām.
Lietošanas indikācijas
IFN ir paredzēts ārstēšanai vīrusu slimības ka trāpīja elpceļi .
Turklāt pacientiem ar hroniskām formām tiek noteikti interferona preparāti hepatīts un delta .
Ārstēšanai vīrusu slimības un jo īpaši galvenokārt tiek izmantots IFN-α (abi ir IFN-alfa 2b un IFN-alfa 2a). Ārstēšanas "zelta standarts". C hepatīts tiek uzskatīti par pegilētiem alfa-2b un alfa-2a interferoniem. Salīdzinot ar tiem, parastie interferoni ir mazāk efektīvi.
Ģenētiskais polimorfisms, kas konstatēts IL28B gēnā, kas ir atbildīgs par IFN lambda-3 kodēšanu, izraisa būtiskas atšķirības ārstēšanas iedarbībā.
Pacienti ar 1. genotipu C hepatīts ar šī gēna kopējām alēlēm, visticamāk, sasniegs ilgākus un izteiktākus ārstēšanas rezultātus, salīdzinot ar citiem pacientiem.
IFN bieži tiek ievadīts arī pacientiem ar onkoloģiskās slimības : ļaundabīgs , aizkuņģa dziedzera endokrīnie audzēji , ne-Hodžkina limfoma , karcinoīdu audzēji ; Kapoši sarkoma , līdz ; matains šūnu leikēmija ,multiplā mieloma , nieru vēzis utt.
Kontrindikācijas
Interferons nav parakstīts pacientiem ar paaugstinātu jutību pret to, kā arī bērniem un pusaudžiem, kuri cieš no smagi garīgi traucējumi un nervu sistēmas traucējumi , ko pavada domas par pašnāvību un pašnāvības mēģinājumi, smagas un ilgstošas.
Kombinācijā ar pretvīrusu zāles ribavirīns IFN ir kontrindicēts pacientiem, kuriem diagnosticēti smagi traucējumi nieres (apstākļi, kādos CC ir mazāks par 50 ml / min).
Interferona preparāti ir kontrindicēti šādos gadījumos (gadījumos, kad atbilstoša terapija nedod gaidīto klīnisko efektu).
Blakus efekti
Interferons pieder pie zāļu kategorijas, kas var izraisīt lielu skaitu nevēlamu reakciju no dažādām sistēmām un orgāniem. Vairumā gadījumu tie ir interferona ievadīšanas rezultāts in / in, s / c vai / m, taču tos var izraisīt arī citas zāļu farmaceitiskās formas.
Visbiežākās IFN lietošanas blakusparādības ir:
- anoreksija;
- slikta dūša;
- drebuļi;
- trīce ķermenī.
Vemšana, pastiprināta, sausa mute, matu izkrišana (), astēnija ; nespecifiski simptomi, kas līdzinās gripas simptomi ; muguras sāpes, depresīvi stāvokļi , muskuļu un skeleta sāpes , domas par pašnāvību un pašnāvības mēģinājumu, vispārējs savārgums, garšas un koncentrēšanās spējas traucējumi, paaugstināta uzbudināmība, miega traucējumi (bieži), arteriālā hipotensija , apjukums.
Retas blakusparādības ir: sāpes labajā pusē vēdera augšdaļā, izsitumi uz ķermeņa (eritematozi un makulopapulāri), pastiprināta nervozitāte, sāpīgums un smags iekaisums injekcijas vietā, sekundāra vīrusu infekcija (ieskaitot infekciju herpes simplex vīruss ), paaugstināts ādas sausums, , sāpes acīs , konjunktivīts neskaidra redze, disfunkcija asaru dziedzeri , trauksme, garastāvokļa labilitāte; psihotiski traucējumi , tostarp paaugstināta agresivitāte utt.; hipertermija , dispepsijas simptomi , elpošanas traucējumi, svara zudums, vaļīgi izkārnījumi, hipertireoze vai hipotireoze , dzirdes traucējumi (līdz pilnīgam zaudējumam), infiltrātu veidošanās plaušās, palielināta ēstgriba, smaganu asiņošana, ekstremitātēs, aizdusa , nieru darbības traucējumi un nieru mazspējas attīstība , perifēra išēmija , hiperurikēmija , neiropātija utt.
Ārstēšana ar IFN zālēm var izraisīt reproduktīvā disfunkcija . Pētījumi ar primātiem ir parādījuši, ka interferons traucē menstruālo ciklu sievietēm . Turklāt sievietēm, kas ārstētas ar IFN-α, līmenis un in.
Šī iemesla dēļ, parakstot interferonu, sievietēm reproduktīvā vecumā jālieto barjeras kontracepcijas līdzekļi . Vīriešiem reproduktīvā vecumā arī ieteicams būt informētiem par iespējamām blakusparādībām.
Retos gadījumos ārstēšanu ar interferonu var papildināt ar oftalmoloģiskiem traucējumiem, kas tiek izteikti kā asinsizplūdumi tīklenē , retinopātija (tostarp, bet ne tikai makulas tūska ), fokusa izmaiņas tīklenē, samazināts redzes asums un/vai ierobežoti redzes lauki, papilledēma , oftalmoloģiskā (otrā galvaskausa) nerva neirīts , artēriju obstrukcija vai tīklenes vēnas .
Dažreiz uz interferona lietošanas fona var attīstīties hiperglikēmija , nefrotiskā sindroma simptomi , . Pacientiem ar cukura diabēts var pasliktināt slimības klīnisko ainu.
Nevar izslēgt iespēju, cerebrovaskulāra asiņošana , multiformā eritēma , audu nekroze injekcijas vietā sirds un cerebrovaskulāra išēmija , hipertrigliceridēmija , sarkoidoze (vai tās gaitas saasināšanās), Laiela sindromi un Stīvenss-Džonsons .
Interferona lietošana atsevišķi vai kombinācijā ar Ribavirīns retos gadījumos tas var izraisīt aplastiskā anēmija (AA) vai pat PAKKM ( pilnīga sarkano kaulu smadzeņu aplazija ).
Bija arī gadījumi, kad uz ārstēšanas ar interferona preparātiem fona pacientam attīstījās dažādas autoimūna un imūnsistēmas izraisīti traucējumi (ieskaitot Verlhofa slimība un Moszkowitz slimība ).
Interferons, lietošanas instrukcijas (metode un devas)
Norādījumi par alfa, beta un gamma interferonu lietošanu norāda, ka pirms zāļu izrakstīšanas pacientam ieteicams noteikt, cik jutīgs pret to ir. kas izraisīja slimību.
Cilvēka leikocītu interferona ievadīšanas metodi nosaka atkarībā no pacientam noteiktās diagnozes. Vairumā gadījumu to izraksta subkutānu injekciju veidā, bet dažos gadījumos zāles var injicēt muskulī vai vēnā.
Ārstēšanas devu, uzturošo devu un ārstēšanas ilgumu nosaka atkarībā no klīniskās situācijas un pacienta organisma reakcijas uz viņam nozīmēto terapiju.
Ar "bērnu" interferonu saprot zāles svecīšu, pilienu un ziežu veidā.
Norādījumi par interferona lietošanu bērniem iesaka lietot šīs zāles kā terapeitisku un profilaktisku līdzekli. Zīdaiņiem un vecākiem bērniem devu izvēlas ārstējošais ārsts.
Profilaktiskos nolūkos INF izmanto šķīduma veidā, kura pagatavošanai izmanto destilētu vai vārītu ūdeni istabas temperatūrā. Gatavais šķīdums ir sarkanā krāsā un ir opalescējošs. Tas jāuzglabā aukstumā ne ilgāk kā 24-48 stundas. Zāles tiek iepilinātas degunā bērniem un pieaugušajiem.
Plkst vīrusu oftalmoloģiskās slimības zāles ir parakstītas acu pilienu veidā.
Tiklīdz slimības simptomu smagums samazinās, instilāciju apjoms jāsamazina līdz vienam pilienam. Ārstēšanas kurss ir no 7 līdz 10 dienām.
Bojājumu ārstēšanai, ko izraisa herpesvīrusi , ziede tiek uzklāta ar plānu kārtu uz skartajām ādas vietām un gļotādām divas reizes dienā, saglabājot 12 stundu intervālu. Ārstēšanas kurss ir no 3 līdz 5 dienām (līdz pilnībā atjaunojas bojātās ādas un gļotādu integritāte).
Profilaksei ORZ un ir jāieeļļo deguna ejas . Procedūru biežums 1. un 3. kursa nedēļā ir 2 reizes dienā. 2. nedēļā ieteicams ieturēt pauzi. Profilakses nolūkos interferons jālieto visu periodu elpceļu slimību epidēmijas .
Rehabilitācijas kursa ilgums bērniem, kuriem bieži ir atkārtotas elpceļu vīrusu un bakteriālas infekcijas , LOR orgāni , atkārtota infekcija ko izraisa herpes simplex vīruss , ir divi mēneši.
Kā audzēt un kā lietot interferonu ampulās?
Norādījumi par interferona lietošanu ampulās norāda, ka pirms lietošanas ampula ir jāatver, jāielej tajā ar ūdeni (destilētu vai vārītu) istabas temperatūrā līdz atzīmei uz ampulas, kas atbilst 2 ml.
Saturu viegli sakrata, līdz tas pilnībā izšķīst. Šķīdumu injicē katrā deguna eja divas reizes dienā, piecus pilienus, saglabājot vismaz sešu stundu intervālu starp injekcijām.
Terapeitiskos nolūkos IFN tiek uzsākts, kad pirmais gripas simptomi . Zāļu efektivitāte ir augstāka, jo ātrāk pacients sāk to lietot.
Visefektīvākā ir inhalācijas metode (caur degunu vai muti). Vienai inhalācijai ieteicams lietot trīs zāļu ampulu saturu, kas izšķīdināts 10 ml ūdens.
Ūdens tiek uzkarsēts līdz temperatūrai, kas nepārsniedz +37 °C. Inhalācijas procedūras tiek veiktas divas reizes dienā, starp tām ievērojot vismaz vienas līdz divu stundu intervālu.
Izsmidzinot vai instilējot, ampulas saturu izšķīdina divos mililitros ūdens un injicē 0,25 ml (vai piecus pilienus) katrā deguna ejā trīs līdz sešas reizes dienā. Ārstēšanas ilgums ir 2-3 dienas.
Profilakses nolūkos deguna pilienus bērniem iepilina (5 pilieni) divas reizes dienā, slimības attīstības sākumposmā tiek palielināts instilāciju biežums: zāles jāievada vismaz piecas līdz sešas reizes dienā katru reizi. stundu vai divas.
Daudzi interesējas par to, vai ir iespējams pilināt interferona šķīdumu acīs. Atbilde uz šo jautājumu ir apstiprinoša.
Pārdozēšana
Interferona pārdozēšanas gadījumi nav aprakstīti.
Mijiedarbība
β-IFN ir saderīgs ar kortikosteroīdu zāles un AKTH. Ārstēšanas laikā nevajadzētu lietot mielosupresīvās zāles , t.sk. citostatiskie līdzekļi (tas var izraisīt aditīvs efekts ).
Ar piesardzību IFN-β tiek nozīmēts kopā ar līdzekļiem, kuru klīrenss lielā mērā ir atkarīgs no citohroma P450 sistēmas (pretepilepsijas zāles , daži antidepresanti un utt.).
Nelietojiet IFN-alfa un Telbivudīns . Vienlaicīga α-IFN lietošana izraisa savstarpēju darbības uzlabošanos saistībā ar. Lietojot kopā ar fosfazīds var savstarpēji palielināties mielotoksicitāte abas zāles (ieteicams rūpīgi uzraudzīt daudzuma izmaiņas granulocīti un;
IFN izmanto arī terapijā, kuras mērķis ir bieži slimu pacientu rehabilitācija. elpceļu infekcijas bērniem.
Optimālākais variants bērnu lietošanai ir deguna pilieni: ar šo lietošanu interferons neiekļūst kuņģa-zarnu traktā (pirms deguna zāļu atšķaidīšanas ūdens jāuzsilda līdz 37 ° C temperatūrai).
Zīdaiņiem interferons tiek izrakstīts svecīšu veidā (150 tūkstoši SV). Sveces bērniem jāievada pa vienai, 2 reizes dienā, ievērojot 12 stundu intervālu starp injekcijām. Ārstēšanas kurss ir 5 dienas. Lai pilnībā izārstētu bērnu SARS Kā likums, pietiek ar vienu kursu.
Ārstēšanai lietojiet 0,5 g ziedes divas reizes dienā. Ārstēšana ilgst vidēji 2 nedēļas. Nākamo 2-4 nedēļu laikā ziede tiek lietota 3 reizes nedēļā.
Daudzas pozitīvas atsauksmes par šo narkotiku liecina, ka šajā zāļu formā tas ir arī pierādījis sevi kā efektīvu ārstēšanu stomatīts un iekaisušas mandeles . Ne mazāk efektīvas ir inhalācijas ar interferonu bērniem.
Zāļu lietošanas ietekme ievērojami palielinās, ja to ievadīšanai tiek izmantots smidzinātājs (ir nepieciešams izmantot ierīci, kas izsmidzina daļiņas, kuru diametrs pārsniedz 5 mikronus). Inhalācijām caur smidzinātāju ir sava specifika.
Pirmkārt, interferons jāieelpo caur degunu. Otrkārt, pirms ierīces lietošanas tajā ir jāizslēdz sildīšanas funkcija (IFN ir proteīns, tas tiek iznīcināts temperatūrā, kas pārsniedz 37 ° C).
Inhalācijām smidzinātājā vienas ampulas saturu atšķaida 2-3 ml destilēta vai minerālūdens (šim nolūkam varat izmantot arī fizioloģisko šķīdumu). Iegūtais apjoms ir pietiekams vienai procedūrai. Procedūru biežums dienas laikā ir no 2 līdz 4.
Ir svarīgi atcerēties, ka bērnu ilgstoša ārstēšana ar interferonu nav ieteicama, jo no tā attīstās atkarība un līdz ar to neattīstās gaidītais efekts.
Interferons grūtniecības laikā
Izņēmums var būt gadījumi, kad gaidāmais terapijas ieguvums topošajai māmiņai būs lielāks par blakusparādību risku un nelabvēlīgu ietekmi uz augļa attīstību.
Nav izslēgta iespēja izolēt rekombinantā IFN sastāvdaļas ar mātes pienu. Sakarā ar to, ka nevar izslēgt iespēju, ka auglis nonāks ar pienu, IFN nav parakstīts sievietēm zīdīšanas laikā.
Ārkārtējos gadījumos, kad nav iespējams izvairīties no IFN iecelšanas, sievietei terapijas laikā ieteicams atteikties no zīdīšanas. Lai mazinātu zāļu blakusparādību (gripas simptomiem līdzīgu simptomu rašanos), ieteicams lietot kopā ar IFN. .
viela-šķīdums: iepakojumi Reg. Nr.: LSR-007009/08
Klīniski farmakoloģiskā grupa:
Izlaišanas forma, sastāvs un iepakojums
viela - risinājums.
pudeles (1) - kartona iepakojumi.
Zāļu aktīvo sastāvdaļu apraksts Interferons alfa-2b»
farmakoloģiskā iedarbība
Interferons. Tas ir ļoti attīrīts rekombinants proteīns ar molekulmasu 19 300 daltoni. Iegūts no Escherichia coli klona, hibridizējot baktēriju plazmīdas ar cilvēka leikocītu gēnu, kas kodē interferona sintēzi. Atšķirībā no interferona alfa-2a ir arginīns 23. pozīcijā.
Tam ir pretvīrusu iedarbība, ko izraisa mijiedarbība ar specifiskiem membrānas receptoriem un RNS sintēzes indukcija un, visbeidzot, olbaltumvielas. Pēdējie savukārt novērš normālu vīrusa vairošanos vai tā izdalīšanos.
Tam ir imūnmodulējoša aktivitāte, kas saistīta ar fagocitozes aktivizēšanu, antivielu un limfokīnu veidošanās stimulāciju.
Tam ir antiproliferatīva iedarbība uz audzēja šūnām.
Indikācijas
Akūts B hepatīts, hronisks B hepatīts, hronisks C hepatīts.
Matšūnu leikēmija, hroniska mieloleikoze, nieru šūnu karcinoma, Kapoši sarkoma uz AIDS fona, ādas T-šūnu limfoma (mycosis fungoides un Cesari sindroms), ļaundabīga melanoma.
Dozēšanas režīms
Ievadiet in / in vai s / c. Devu un ārstēšanas shēmu nosaka individuāli, atkarībā no indikācijām.
Blakusefekts
Gripai līdzīgi simptomi: bieži - drudzis, drebuļi, sāpes kaulos, locītavās, acīs, mialģija, galvassāpes, pastiprināta svīšana, reibonis.
No gremošanas sistēmas: iespējama apetītes samazināšanās, slikta dūša, vemšana, caureja, aizcietējums, garšas sajūtas traucējumi, sausa mute, svara zudums, vieglas sāpes vēderā, nelielas izmaiņas aknu darbības testos (parasti normāli pēc ārstēšanas beigām).
No centrālās nervu sistēmas un perifērās nervu sistēmas puses: reti - reibonis, garīga pasliktināšanās, miega traucējumi, atmiņas traucējumi, trauksme, nervozitāte, agresivitāte, eiforija, depresija (pēc ilgstošas ārstēšanas), parestēzija, neiropātija, trīce; dažos gadījumos - tieksme uz pašnāvību, miegainība.
No sirds un asinsvadu sistēmas puses: iespējama - tahikardija (ar drudzi), arteriāla hipotensija vai hipertensija, aritmija; dažos gadījumos - sirds un asinsvadu sistēmas pārkāpumi, koronāro artēriju slimība, miokarda infarkts.
No elpošanas sistēmas: reti - sāpes krūtīs, klepus, neliels elpas trūkums; dažos gadījumos - pneimonija, plaušu tūska.
No hematopoētiskās sistēmas: iespējama neliela leikopēnija, trombocitopēnija, granulocitopēnija.
Dermatoloģiskas reakcijas: iespējama nieze, atgriezeniska alopēcija.
Citi: reti - muskuļu stīvums; atsevišķos gadījumos - antivielas pret dabiskajiem vai rekombinantajiem interferoniem.
Kontrindikācijas
Smagas sirds un asinsvadu slimības, dekompensēta aknu ciroze, smaga depresija, psihoze, atkarība no alkohola vai narkotikām, paaugstināta jutība pret alfa-2b interferonu.
Grūtniecība un laktācija
Lietošana grūtniecības laikā ir iespējama tikai tad, ja paredzamais ieguvums no terapijas mātei pārsniedz iespējamo risku auglim.
Nav zināms, vai alfa-2b interferons izdalās mātes pienā. Ja nepieciešams, lietošana zīdīšanas laikā jāizlemj par zīdīšanas pārtraukšanu.
Sievietēm reproduktīvā vecumā ārstēšanas laikā jālieto droša kontracepcijas metode.
Pieteikums par aknu darbības traucējumiem
Kontrindicēts dekompensētas aknu cirozes gadījumā. Lietojiet piesardzīgi pacientiem ar aknu darbības traucējumiem.
Pieteikums par nieru darbības traucējumiem
Lietojiet piesardzīgi pacientiem ar pavājinātu nieru darbību.
Speciālas instrukcijas
Lietojiet piesardzīgi pacientiem ar pavājinātu nieru, aknu, kaulu smadzeņu hematopoēzi, kuriem ir tendence uz pašnāvības mēģinājumiem.
Pacientiem ar sirds un asinsvadu sistēmas slimībām ir iespējama aritmija. Ja aritmija nesamazinās vai palielinās, deva jāsamazina 2 reizes vai ārstēšana jāpārtrauc.
Ārstēšanas laikā ir nepieciešams kontrolēt neiroloģisko un garīgo stāvokli.
Ar nopietnu kaulu smadzeņu hematopoēzes kavēšanu ir nepieciešams regulārs perifēro asiņu sastāva pētījums.
Alfa-2b interferonam ir stimulējoša iedarbība uz imūnsistēmu, tādēļ tas jālieto piesardzīgi pacientiem, kuriem ir nosliece uz autoimūnām slimībām, jo ir paaugstināts autoimūnu reakciju risks.
zāļu mijiedarbība
zāļu mijiedarbība
Interferons alfa-2b kavē teofilīna metabolismu un samazina tā klīrensu.
Izgudrojums attiecas uz gēnu inženieriju, biotehnoloģiju, medicīnu, farmakoloģiju. Jauna rekombinantā daudzkopiju plazmīda DNS pSX50, kas kodē cilvēka leikocītu alfa-2b interferona sintēzi, kura ekspresiju kontrolē laktozes un triptofāna promotori un transkripcijas terminators. Recipienta celma E. coli BL21 šūnu transformācijas rezultātā ar rekombinanto plazmīdu DNS pSX50 tika iegūts E. coli SX50 celms - rekombinantā cilvēka leikocītu interferona alfa-2b ražotājs ar produktivitāti līdz 0,9-1,0. g interferona alfa-2b uz 1 litru barotnes. Rekombinantā alfa-2b interferona iegūšanas metode ir balstīta uz izveidotā rekombinantā celma E. coli SX50 izmantošanu un ietver tā dziļu kultivēšanu uz barotnes ar samazinātu triptofāna saturu, nepārtraukti pievienojot barības vielu substrātus biosintēzes laikā, mehāniski iznīcinot mikroorganismu šūnas augstā spiedienā, agregētā proteīna izšķīdināšana koncentrētā guanidīna hidrohlorīda šķīdumā, kam seko interferona renaturēšana fizioloģiskos buferšķīdumos haotropu aģentu klātbūtnē un tā attīrīšana, izmantojot trīspakāpju interferona hromatogrāfisku attīrīšanu uz sveķiem, piemēram, helātu sefarozes. Fast Flow imobilizēta ar Cu +2 joniem, jonu apmaiņas hromatogrāfija uz jonu apmaiņas sveķiem, piemēram, SM Sephsrose Fast Flow, un gēla filtrēšanas hromatogrāfija uz Superdex 75 tipa sveķiem. jah, krāsojot želejas ar sudrabu un vairāk nekā 98% saskaņā ar RF HPLC un bez pirogēnu (LAL-tests) daudzumos vismaz 400-800 mg uz 1 litru barotnes. 3 n. un 3 z.p f-ly, 6 ill.
RF patenta 2242516 rasējumi
Izgudrojums attiecas uz ģenētiski modificētām zālēm, kas iegūtas ar biotehnoloģiskiem līdzekļiem, proti, uz metodēm rekombinantā cilvēka leikocītu alfa-2b interferona rūpnieciskai ražošanai medicīniskiem nolūkiem (turpmāk tekstā – interferons), kā arī uz rekombinantiem celmiem, kas ražo Escherichia coli (E. coli) un plazmīdas DNS, kas kodē interferona sintēzi.
Interferoni ir olbaltumvielu molekulas ar molekulmasu no 15 000 līdz 21 000 daltonu, ko ražo un izdala šūnas, reaģējot uz vīrusu infekciju vai citiem patogēniem. Ir trīs galvenās interferonu grupas: alfa, beta un gamma. Šīs grupas pašas par sevi nav viendabīgas un var saturēt vairākas dažādas interferona molekulārās šķirnes. Tādējādi ir identificētas vairāk nekā 14 alfa interferona ģenētiskās šķirnes, kas ir interesantas un tiek plaši izmantotas medicīnā kā pretvīrusu, antiproliferatīvi un imūnmodulējoši līdzekļi.
Zināmas metodes cilvēka leikocītu interferona iegūšanai no cilvēka leikocītiem, ko inducējuši vīrusi un citi induktori (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).
Šo interferonu ražošanas metožu galvenais trūkums ir iespējamība, ka galaprodukts tiks inficēts ar cilvēka vīrusiem, piemēram, B un C hepatīta vīrusu, imūndeficīta vīrusu utt.
Šobrīd par daudzsološāku ir atzīta metode interferona iegūšanai ar mikrobioloģisko sintēzi, kas ļauj iegūt mērķa produktu ar daudz lielāku ražu no salīdzinoši lētas izejvielas. Šajā gadījumā izmantotās pieejas ļauj izveidot strukturālā gēna variantus, kas ir optimāli baktēriju ekspresijai, kā arī regulējošos elementus, kas kontrolē tā ekspresiju.
Kā sākotnējie mikroorganismi tiek izmantoti dažāda dizaina Pichia pastoris, Pseudomonas putida un Escherichia coli celmi.
P. pastoris kā interferona ražotāja izmantošanas trūkums (J.N. Garcia, J.A. Aguiar et. al. //High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris.//Biotecnologia Aplicada, 12(3),152-155, 1995 ), ir ārkārtīgi sarežģīti apstākļi šāda veida rauga fermentācijai, nepieciešamība stingri uzturēt induktora, jo īpaši metanola, koncentrāciju biosintēzes procesā. Ps celmu izmantošanas trūkums. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) ir fermentācijas procesa sarežģītība zemā ekspresijas līmenī (10 mg interferona uz 1 litru barotnes). Produktīvāka ir Escherichia coli celmu izmantošana (Semin. Oncol., 1997, jūnijs; 24 (3 Suppl. 9): S9-41-S9-51).
Ir zināms liels skaits plazmīdu un interferonu ekspresējošu E. coli celmu: E. coli celmi ATCC 31633 un 31644 ar plazmīdām Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 vai Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN3 AHL6 (SU 1764515), E. coli celms pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli celms pINF-F-Pa (AU 1312962), E. coli celms SG 20050 ar p280/21FN plazmīdu (Kravchenko Bioetalorganic.V. ķīmija, 1987, 13. v., Nr. 9, 1186.-1193. lpp.), E. coli SG 20050 celms ar pINF14 plazmīdu (SU 1703691), E. coli SG 20050 celms ar pINF16 plazmīdu (RU 20 uc) un 54004. Tehnoloģiju trūkums, kas balstās uz šo celmu izmantošanu, ir to nestabilitāte, kā arī nepietiekams interferona ekspresijas līmenis.
Līdzās izmantoto celmu īpašībām procesa efektivitāte lielā mērā ir atkarīga no interferona izolēšanai un attīrīšanai izmantotās tehnoloģijas.
Zināma metode interferona ražošanai, kas ietver šūnu Ps kultivēšanu. putida, biomasas iznīcināšana, polietilēnimīna apstrāde, amonija sulfāta frakcionēšana, hidrofobā hromatogrāfija uz fenilsilohroma C-80, lizāta pH frakcionēšana, tā koncentrācija un diafiltrācija, jonu apmaiņas hromatogrāfija uz DE-52 celulozes, pH gradienta eluēšana, hromatogrāfija ar jonu apmaiņu iegūtais eluents uz CM celulozes -52, koncentrācija, izlaižot caur filtra kaseti un gēla filtrēšana uz Sephadex G-100 (SU 1640996). Šīs metodes trūkums, papildus sarežģītai daudzpakāpju fermentācijai, ir daudzpakāpju process gala produkta iegūšanai.
Ir zināma arī metode interferona iegūšanai, kas ietver E. coli SG 20050/pIF16 celma kultivēšanu LB buljonā kolbās termostatētā kratītājā, biomasas centrifugēšanu, mazgāšanu ar buferšķīdumu un apstrādi ar ultraskaņu, lai iznīcinātu šūnas. Iegūto lizātu centrifugē, mazgā ar 3 M urīnvielas buferšķīdumā, izšķīdina guanidīna hlorīda buferšķīdumā, apstrādā ar ultraskaņu, centrifugē, veic oksidatīvo sulfitolīzi, dialīzi pret 8 M urīnvielu, renaturāciju un pēdējo divu posmu hromatogrāfiju uz CM-52 G celulozes un Sephadex. -50 (RU 2054041). Šīs metodes trūkumi ir tās salīdzinoši zemā produktivitāte izolēšanas un attīrīšanas procesa galvenajos posmos. Jo īpaši tas attiecas uz produkta ultraskaņas apstrādi, dialīzi un oksidatīvo sulfitolīzi, kas izraisa interferona iznākuma nestabilitāti, kā arī neiespējamību izmantot šo metodi interferona rūpnieciskai ražošanai.
Kā tuvāko analogu (prototipu) var norādīt cilvēka leikocītu interferona iegūšanas metodi, kas sastāv no rekombinantā E. coli celma kultivēšanas, iegūtās biomasas sasaldēšanas temperatūrā, kas nepārsniedz -70 °C, atkausēšanas, mikroorganismu šūnu iznīcināšanas ar lizocīms, DNS un RNS atdalīšana, ievadot DNāzes lizātā un izolētās nešķīstošās interferona formas attīrīšana, mazgājot ar buferšķīdumu ar mazgāšanas līdzekļiem, interferona nogulsnes izšķīdinot guanidīna hidrohlorīda šķīdumā, renaturāciju un vienpakāpes attīrīšanu ar jonu - apmaiņas hromatogrāfija. Kā ražotājs tiek izmantots E. coli SS5 celms, kas iegūts, izmantojot rekombinanto pSS5 plazmīdu, kas satur trīs promotorus: Plac, Pt7 un P trp, un alfa-interferona gēnu ar ieviestām nukleotīdu aizvietotājiem.
Interferona ekspresiju ar E. coli SS5 celmu, kas satur šo plazmīdu, kontrolē trīs promotori: Plac, Pt7 un P trp. Interferona ekspresijas līmenis ir aptuveni 800 mg uz 1 litru šūnu suspensijas (RU 2165455).
Šīs metodes trūkums ir zemā izgatavojamība, izmantojot mikroorganisma šūnu, DNS un RNS enzīmu iznīcināšanu un interferona vienpakāpes hromatogrāfisko attīrīšanu. Tas izraisa interferona izolēšanas procesa nestabilitāti, noved pie tā kvalitātes pazemināšanās un ierobežo iespēju izmantot iepriekš minēto shēmu interferona rūpnieciskai ražošanai. Šīs plazmīdas un uz tās balstītā celma trūkumi ir spēcīga neregulēta T7 fāga promotora izmantošana plazmīdā E. coli BL21 (DE3) celmā, kurā T7 RNS polimerāzes gēns atrodas zem lac operona promotora un kas vienmēr "plūst". Līdz ar to šūnā nepārtraukti notiek interferona sintēze, kas noved pie plazmīdas disociācijas un celma šūnu dzīvotspējas samazināšanās, kā rezultātā samazinās interferona iznākums.
Šī izgudrojuma mērķis ir izveidot rekombinantu rūpniecisko E. coli ražotāja celmu, izmantojot jaunu rekombinanto plazmīdu DNS ar augstu interferona biosintēzes līmeni, un izstrādāt efektīvu rūpniecisko tehnoloģiju interferona vielas iegūšanai medicīniskiem nolūkiem, kas atbilst kvalitātei. uz "Eiropas Farmakopeju" attiecībā uz alfa-2b interferona vielu.
Šī problēma tika atrisināta, izveidojot rekombinanto plazmīdu DNS pSX50 un Escherichia coli SX50 celmu, kas deponēts Federālā valsts vienotā uzņēmuma GosNII Genetics Viskrievijas rūpniecisko celmu kolekcijā ar numuru VKPM V-8550,
kā arī metode rekombinantā alfa-2b interferona iegūšanai, pamatojoties uz rekombinantā E. coli SX50 celma izmantošanu un ietverot tā dziļu kultivēšanu uz barotnes ar samazinātu triptofāna saturu ar nepārtrauktu barības vielu substrātu pievienošanu biosintēzes laikā, mehānisku iznīcināšanu. mikroorganismu šūnām augstā spiedienā, agregētā proteīna izšķīdināšana koncentrētā guanidīna hidrohlorīda šķīdumā, kam seko interferona renaturācija fizioloģiskos buferšķīdumos haotropu aģentu klātbūtnē un interferona trīspakāpju hromatogrāfiska attīrīšana uz sveķiem, piemēram, helātu sefarozes ātrās plūsmas, imobilizēta ar Cu +2 joniem, jonu apmaiņas hromatogrāfija uz jonu apmaiņas sveķiem, piemēram, CM Sepharose Fast Flow, un gēla filtrēšanas hromatogrāfija uz sveķiem, piemēram, Superdex 75.
Saskaņā ar izgudrojumu tiek piedāvāta jauna rekombinantā daudzkopiju plazmīda DNS pSX50, kas kodē cilvēka leikocītu interferona alfa-2b sintēzi, kura ekspresiju kontrolē laktozes un triptofāna promotori un transkripcijas terminators. Plazmīdai pSX50 ir 3218 bāzes pāri (bp), un to raksturo šādu fragmentu klātbūtne:
Secība no 1 nukleotīda līdz 176 nukleotīdiem (n) ietver 176 bp DNS fragmentu, kas satur triptofāna promotoru (P trp);
Secība no mūsu ēras 177. gada līdz mūsu ēras 194. gadam ietver sintētisku DNS fragmentu 18 bp, kas satur Shine Delgarno sekvenci, kas ir atbildīga par translācijas ierosināšanu;
Secība no mūsu ēras 195. gada līdz mūsu ēras 695. gadam ietver 501 bp DNS fragmentu, kas satur interferona gēna secību ar šādām nukleotīdu aizvietotājiem: 37. pozīcijā A ir aizstāts ar C; 39. pozīcijā G ir aizstāts ar T; 40. pozīcijā A ir aizstāts ar C; un pozīcijā 42, G aizstāts ar T , 67. pozīcijā mainīt A uz C, 69. pozīcijā mainīt G uz T, 70. pozīcijā mainīt A uz C, 72. pozīcijā mainīt A uz T, 96. pozīcijā mainīt G uz A, pozīcijā 100 nomainiet A pret C, 102. pozīcijā mainiet A pret T, 114. pozīcijā mainiet A pret C, 120. pozīcijā mainiet C uz G, 126. pozīcijā mainiet G uz A, 129. pozīcijā mainiet G uz A, 330. pozīcijā mainīt C uz G, 339. pozīcijā G maiņa uz A, 342. pozīcijā G maiņa uz A, 487. pozīcijā A maiņa uz C, 489. pozīcijā A maiņa uz T, 495. pozīcijā G maiņa uz A;
Secība no 696. gada mūsu ēras līdz 713. gadam pēc Kristus ietver sintētisku DNS fragmentu ar 18 bp, kas satur sintētisko polilinkeru;
Secība no mūsu ēras 714. gada līdz 1138. gadam pēc Kristus ietver plazmīdas pKK223-3 DNS fragmentu ar 4129 b.p. līdz mūsu ēras 4553. gadam 425 bp lielums, kas satur stingrā transkripcijas terminatora rrnBT 1 T 2 secību;
Secība no 1139. gada mūsu ēras līdz mūsu ēras 1229. gadam ietver plazmīdas pUC19 DNS fragmentu no 2487 b.p. līdz mūsu ēras 2577. gadam izmērs 91 p.O., kas satur β-laktomāzes gēna promotoru (ampicilīna rezistences gēns - Amp R);
Secība no 1230. gada mūsu ēras līdz 2045. gadam p.m.ē. ietver pUC4K plazmīdas DNS fragmentu ar 720 b.p. līdz mūsu ēras 1535. gadam 816 bp liels, kas satur kan gēna strukturālo reģionu;
Secība no 2046. gada AD līdz mūsu ēras 3218. gadam ietver plazmīdas pUC19 DNS fragmentu no 1625 līdz 453 b.p. izmērs 1173 BP, kas satur sekvenci, kas ir atbildīga par plazmīdas (ori) un lac promotora (P lac) replikāciju.
Attēlos 1-5 parādītas pSX50 plazmīdas uzbūves shēmas un fiziskā karte.
6. attēlā parādīta pilna nukleotīdu secība, kas noteikta plazmīdai pSX50.
Escherichia coli SX50 celms tika iegūts, transformējot Escherichia coli BL21 šūnas ar pSX50 plazmīdu, izmantojot tradicionālo gēnu inženierijas tehnoloģiju. E.Coli SX50 celmu raksturo šādas īpašības.
Kultūras un morfoloģiskās iezīmes
Šūnas ir mazas, taisnas, sabiezinātas stieņa formas, gramnegatīvas, bez sporām. Šūnas labi aug uz vienkāršām uzturvielu barotnēm. Audzējot uz Difko agara, veidojas apaļas, gludas, izliektas, duļķainas, spīdīgas, pelēkas kolonijas, ar gludām malām. Audzējot šķidrā barotnē (minimālā barotnē ar glikozi vai LB-buljonā), tie veido intensīvu vienmērīgu dūmaku.
Fizikāli bioloģiskās īpašības
Aerobe. Augšanas temperatūras diapazons ir 4-42°C pie optimālā pH 6,5-7,5.
Kā slāpekļa avots tiek izmantoti gan minerālsāļi amonija un nitrātu formās, gan organiskie savienojumi aminoskābju veidā, peptons, triptons, rauga ekstrakts u.c.
Kā oglekļa avots tiek izmantotas aminoskābes, glicerīns, ogļhidrāti. Antibiotiku rezistence. Šūnas uzrāda rezistenci pret kanamicīnu (līdz 100 µg/ml).
Escherichia coli 8X50 celms ir interferona ražotājs.
Celma uzglabāšanas metode, apstākļi un barotnes sastāvs
L-arapē ar kanamicīna pievienošanu līdz koncentrācijai 20 μg / ml zem eļļas, L-buljonā, kas satur 15% glicerīna un atbilstošas antibiotikas ampulās mīnus 70 ° C temperatūrā, liofilizētā stāvoklī ampulās temperatūra plus 4°C.
Escherichia coli SX50 celmu identificēja Bergi's Key (1974) kā Escherichia coli sugas celmu.
Alfa-2b interferona rūpnieciskās ražošanas metode
Ierosinātās metodes iezīme ir tādas tehnoloģijas izstrāde, kas ļauj izolēt interferonu no nešķīstošās formas, kas uzkrājas fermentācijas laikā, kas var ievērojami vienkāršot izolācijas procesa tehnoloģisko shēmu un palielināt mērķa produkta iznākumu.
Metode sastāv no Escherichia coli SX50 celma kultivēšanas barotnē, pastāvīgi pievienojot barības vielu substrātus, vēlams glikozi un rauga ekstraktu, biosintēzes laikā, vēlams ar samazinātu triptofāna saturu, mehāniski iznīcinot mikroorganismu šūnas pie augsta spiediena 700 -900 bāri, interferona izšķīdināšana bufera guanidīna hidrohlorīda šķīdumā, interferona renaturēšana fizioloģiskos buferšķīdumos haotropu aģentu klātbūtnē, kam seko interferona trīspakāpju hromatogrāfiska attīrīšana uz sveķiem, piemēram, helātu sefarozes ātrās plūsmas, kas imobilizēta ar Cu +2. joni, jonu apmaiņas hromatogrāfija uz jonu apmaiņas sveķiem, piemēram, CM Sepharose Fast Flow, un gēla filtrēšanas hromatogrāfija uz sveķiem, piemēram, Superdex 75.
Optimālie nosacījumi atsevišķu interferona iegūšanas posmu veikšanai ir šādi:
Fermentācija tiek veikta, nepārtraukti pievienojot substrātus visā procesā, kas noved pie augsta interferona ekspresijas līmeņa;
Šūnu iznīcināšana tiek veikta Gaulin tipa dezintegratorā ar spiedienu 900 bāri;
Šķīstošo šūnu komponentu (DNS, RNS, proteīnu, lipopolisaharīdu uc) izņemšana tiek veikta, mazgājot nešķīstošo interferona formu ar buferšķīdumiem, kas satur mazgāšanas līdzekļus (Triton XI00, urīnviela utt.);
Iegūtās nogulsnes, kas satur interferonu, izšķīdina 6 M guanidīna hidrohlorīda buferšķīdumā;
Interferona renaturāciju veic fizioloģiskā buferšķīdumā, kas satur haotropus līdzekļus;
Interferona trīspakāpju hromatogrāfiskā attīrīšana tiek veikta ar Chelatating Sepharose Fast Flow, kas imobilizēta ar Cu +2 joniem, uz katjonu apmaiņas sveķiem CM Sepharose Fast Flow un gēla filtrācijas hromatogrāfiju uz sveķu tipa Superdex 75;
Pēc katras hromatogrāfiskās attīrīšanas sterilizējošo filtrēšanu veic caur pirogēnu nesaturošiem filtriem ar poru izmēru 0,22 μm.
Interferona izlaide, izmantojot aprakstīto metodi, ir aptuveni 400-800 mg interferona ar 1 litru barotnes. Iegūtā produkta kvalitāte atbilst "Eiropas Farmakopejas" standartiem un prasībām attiecībā uz vielu alfa-2b interferonu.
Būtiskas atšķirības starp piedāvāto metodi un prototipu ir:
Celma konstrukcijas izmantošana ar augstāku produktivitāti, kas ļauj iegūt lielāku interferona daudzumu no 1 litra barotnes biosintēzes laikā;
Šūnu biomasas efektīvas mehāniskas iznīcināšanas izmantošana, kas ļauj iegūt tīrāku interferona nešķīstošās formas ekstraktu īsākā laikā ar mazākiem zaudējumiem;
Fizioloģisko buferšķīdumu izmantošana renaturācijas laikā haotropu līdzekļu klātbūtnē ļauj palielināt pareizi renaturētas interferona formas iznākumu;
Interferona trīspakāpju hromatogrāfiskā attīrīšana ļauj iegūt interferona vielu, kuras tīrība ir lielāka par 99% saskaņā ar elektroforēzi reducējošos un nereducējošos apstākļos, kad gēli ir krāsoti ar sudrabu un vairāk nekā 98% saskaņā ar RF HPLC un praktiski nesatur pirogēni (LAL tests).
Pieprasītās izgudrojumu grupas būtība un priekšrocības ir ilustrētas ar sekojošiem piemēriem.
1. piemērs Rekombinantās plazmīdas pSX50 konstruēšana
Plazmīdas pSX50 konstruēšanas metode ietver šādas darbības:
Vektora plazmīdas pSX10 konstruēšana;
1. Plazmīdas pSX3 (2641 bp) konstruēšana
2. vektora plazmīdas pSX10 (2553 bp) konstruēšana
Rekombinantās plazmīdas pSX41 (3218 bp) konstruēšana;
Rekombinantās plazmīdas pSX43 (3218 bp) konstruēšana;
Rekombinantās plazmīdas pSX45 (3218 bp) konstruēšana;
Rekombinantās plazmīdas pSX50 (3218 bp) konstruēšana.
Vektora plazmīdas pSX10 konstruēšana
pSX10 vektora plazmīda ir pUC19 vektors, kurā ampicilīna rezistences beta-laktamāzes gēnu kodējošā secība ir aizstāta ar kan gēnu kodējošo secību un satur pKK223-3 plazmīdas transkripcijas terminatoru.
Vektora plazmīdas pSS10 konstruēšana tiek veikta divos posmos:
Plazmīdas pSX3 (2641 p. O.) iegūšana, kas pārstāv plazmīdu pUC19, kurā amp gēna kodējošais reģions ir aizstāts ar kan gēna kodējošo reģionu;
Vektora plazmīdas pSX10 (2553 bp) iegūšana, kas ir plazmīda pSX3, kurā aiz BamHI vietas ir ievietots DNS fragments, kas kodē transkripcijas terminatoru ggBT 1 T2.
Lai iegūtu plazmīdu pSX3, veiciet piecas DNS amplifikācijas kārtas ar PCR (polimerāzes ķēdes reakciju). Pirmajā kārtā, par veidni izmantojot pUC19 plazmīdas DNS, tiek veikta 1828 bp DNS fragmenta amplifikācija. (fragments PU1-PU2), izmantojot primerus:
Šo un turpmākās PCR reakcijas veic šādos apstākļos: 20 mM Tis-HCl, pH 8,8, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 tM MgCl2, 0,1% Triton X100, 0,1 mg/ml BSA, 0,2 mM katra dNTP, 1,25 u Pfu DNS polimerāze, 100 ng DNS. Pastiprināšanas process sastāv no šādiem posmiem: karsēšana 95°C 5 minūtes, 35 PCR cikli (30 sek 95°C, 30 sek 56°C, 2 min 72°C) un inkubācija 10 minūtes 72°C temperatūrā. Pēc amplifikācijas (un pēc sekojošām pastiprināšanām) DNS fragmentu elektroforētiski attīra uz 1% agarozes gēla. Otrajā un trešajā kārtā, par veidni izmantojot pUC4K plazmīdas DNS, tiek veikta 555 bp DNS fragmenta amplifikācija. (fragments KM1-KM2), izmantojot primerus:
un 258 bp DNS fragmenta amplifikācija. (KMZ-KM4) ar gruntskrāsām
Piektajā PCR kārtā fragmenti (PU1-PU2) un (KM1-KM4) tiek apvienoti šādos apstākļos: karsēšana 95°C 5 minūtes, 5 PCR cikli (30 sek 95°C, 30 sek 56°). C, 10 min 72°C) un inkubē 10 minūtes 72°C temperatūrā. DNS, kas iegūta pēc pēdējās PCR, tieši transformē E. coli DH5 šūnās un izklāj uz LA barotnes, kas satur 20 μg/ml kanamicīna. Pēc 12 stundu inkubācijas 37°C temperatūrā klonus izrauj, izolē plazmīdas DNS un veic restrikcijas analīzi. Rezultātā tiek iegūta 2641 bp pSX3 plazmīda.
Lai iegūtu vektora plazmīdu pSX10, tika veiktas trīs DNS amplifikācijas kārtas ar PCR. Pirmajā kārtā, izmantojot pSX3 plazmīdas DNS kā veidni, tiek veikta 2025 bp DNS fragmenta amplifikācija. (fragments 10.1-10.2), izmantojot primerus:
Otrajā kārtā, par veidni izmantojot pKK223-3 plazmīdas DNS, tiek veikta 528 bp DNS fragmenta amplifikācija. (fragments KK1-KK2), izmantojot primerus:
Trešajā PCR kārtā fragmenti (10.1-10.2) un (KK1-KK2) tiek apvienoti šādos apstākļos: karsēšana 95°C 5 minūtes, 5 PCR cikli (30 sek 95°C, 30 sek 56°C). , 10 min 72°C) un inkubāciju 10 minūtes 72°C temperatūrā. DNS, kas iegūta pēc pēdējās PCR, tieši transformē E. coli DH5 šūnās un izklāj uz LA barotnes, kas satur 20 μg/ml kanamicīna. Pēc 12 stundu inkubācijas 37°C temperatūrā klonus izrauj, izolē plazmīdas DNS un veic restrikcijas analīzi. Rezultāts ir 2553 bp pSX10 plazmīda.
Rekombinantās plazmīdas pSX41 konstruēšana
Rekombinantā plazmīda pSX41 ir vektora plazmīdas pSX3 Hind III - BamHI DNS fragments (2529 bp), Hind III - EcoRI DNS fragments 168 bp, kas kodē E. coli triptofāna operona promotoru (P trp), EcoRI-XbaI a 20 bp. sintētiskais DNS fragments, kas kodē SD sekvenci (Shine-Delgarno) un 501 bp XbaI-BamHI DNS fragments, kas kodē cilvēka interferona alfa 2b gēnu.
Lai iegūtu vektora plazmīdas pSX3 (2529 bp) Hind III - VamHI DNS fragmentu, pSX3 plazmīdas DNS apstrādā ar restrikcijas enzīmiem HindIII un BamHI, kam seko elektroforētiskā attīrīšana 1% agarozes gēlā. Hind III EcoRI DNS fragments 168 bp, kas kodē triptofāna operona (P trp) promotoru, tika iegūts ar PCR, izmantojot kopējo E. coli DNS kā veidni un primerus TRP1 un PRP2, kam sekoja amplificētā fragmenta apstrāde ar Hindlll un EcoRI ierobežojumu. fermenti:
Lai iegūtu EcoRI-Xbal, 20 bp sintētisku DNS fragmentu, kas kodē SD secību (Shine-Delgarno), tiek sintezēti šādi komplementāri oligonukleotīdi:
501 bp XbaI-BamIII DNS fragmentu, kas kodē cilvēka interferona alfa 2b gēnu, iegūst ar PCR, izmantojot kopējo cilvēka DNS kā veidni un IFN1 un IFN2 primerus, kam seko amplificētā fragmenta apstrāde ar Xbal un BamIII restrikcijas enzīmiem:
Pēc tam elektroforētiski attīrītos fragmentus apvieno, ligē ar T4 fāga ligāzes enzīmu, DNS transformē E. coli DH5 šūnās un izklāj uz LA barotnes, kas satur 20 μg/ml kanamicīna. Pēc 12 stundu inkubācijas 37°C temperatūrā klonus izrauj, izolē plazmīdu DNS, veic restrikcijas analīzi un nosaka DNS primāro struktūru. Rezultāts ir 3218 bp pSX41 plazmīda. Pēc tam tiek veikta pakāpeniska interferona gēna mutaģenēze, lai palielinātu mērķa produkta ekspresijas līmeni. Interferona gēna mutaģenēze sastāv no E. coli reti sastopamo tripletu aizstāšanas, kas kodē atbilstošās aminoskābes, ar tripletiem, kas bieži sastopami E. coli un kodē tās pašas aminoskābes. Interferona gēna DNS mutaģenēzi veic ar PCR.
Rekombinantās plazmīdas pSX43 konstruēšana
Lai iegūtu rekombinanto plazmīdu pSX43, vienu DNS amplifikācijas kārtu veic ar PCR, izmantojot plazmīdas pSX41 DNS kā šablonu un praimerus IFN3 un IFN4:
PCR veic šādos apstākļos: karsēšana 95°C 5 minūtes, 20 PCR cikli (30 sek 95°C, 30 sek 56°C, 10 min 72°C) un inkubācija 20 minūtes 72°C. Pēc PCR iegūto DNS tieši transformē E. coli DH5 šūnās un uzklāj uz LA barotnes, kas satur 20 μg/ml kanamicīna. Pēc 12 stundu inkubācijas 37°C temperatūrā klonus izrauj, izolē plazmīdu DNS, veic restrikcijas analīzi un nosaka DNS primāro struktūru. Rezultātā tiek iegūta 3218 bp pSX43 plazmīda.
Rekombinantās plazmīdas pSX45 konstruēšana
Lai iegūtu rekombinanto plazmīdu pSX45, tiek veikta viena DNS amplifikācijas kārta ar PCR, izmantojot pSX43 plazmīdas DNS kā veidni un primerus IFN5 un IFN6:
PCR veic šādos apstākļos: karsēšana 95°C 5 minūtes, 20 PCR cikli (30 sek 95°C, 30 sek 56°C, 10 min 72°C) un inkubācija 20 minūtes 72°C. Pēc PCR iegūto DNS tieši transformē E. coli DH5 šūnās un uzklāj uz LA barotnes, kas satur 20 μg/ml kanamicīna. Pēc 12 stundu inkubācijas 37°C temperatūrā klonus izrauj, izolē plazmīdu DNS, veic restrikcijas analīzi un nosaka DNS primāro struktūru. Rezultāts ir 3218 bp pSX45 plazmīda.
Rekombinantās plazmīdas pSX50 konstruēšana.
Lai iegūtu rekombinanto plazmīdu pSX50, tiek veikta viena DNS amplifikācijas kārta ar PCR, izmantojot pSX45 plazmīdas DNS kā veidni un primerus IFN7 un IFN8:
PCR veic šādos apstākļos: karsēšana 95°C 5 minūtes, 20 PCR cikli (30 sek 95°C, 30 sek 56°C, 10 min 72°C) un inkubācija 20 minūtes 72°C. Pēc PCR iegūto DNS tieši transformē E. coli DH5 šūnās un uzklāj uz LA barotnes, kas satur 20 μg/ml kanamicīna. Pēc 12 stundu inkubācijas 37°C temperatūrā klonus izrauj, izolē plazmīdu DNS, veic restrikcijas analīzi un nosaka DNS primāro struktūru. Rezultāts ir 3218 bp pSX50 plazmīda.
2. piemērs. E. coli SX50 celma iegūšana – interferona ražotājs
E. coli SX50 interferonu ražojošo celmu iegūst, transformējot E. coli BL21 celma šūnas ar rekombinanto pSX50 plazmīdu. Interferonu ražojošo celmu audzē 30 l fermentatorā līdz optiskajam blīvumam 25,0-30,0 o.u. barotnē M9, kas satur 1% kazeīna skābes hidrolizāta (Difco), 1% glikozes, 40 µg/ml kanamicīna, 38-39°C temperatūrā. Fermentācijas procesā, izmantojot gravimetrisko kontrolieri, tiek veikta nepārtraukta barības vielu substrāta pievienošana.
3. piemērs Interferona izdalīšanas metode no E. coli SX50 celma
Interferons tika iegūts 4 posmos:
1. posms. E. coli SX50 celma kultivēšana.
2. posms. Interferona nešķīstošās formas izolēšana un attīrīšana.
3. posms. Interferona šķīdināšana un renaturācija.
4. posms. Interferona hromatogrāfiskā attīrīšana.
1. posms. Celma E. coli SX50 kultivēšana
Izaudzēto E. coli SX50 celma inokulātu 3 litru tilpumā bagātīgas LB barotnes 12 stundas 26°C temperatūrā aseptiski ievada fermentatorā, kas satur 27 litrus sterilas barotnes, kas satur M9, 1% kazeīna skābes hidrolizātu, 1 % glikozes, 1 mm MgCl 2, 0,1 mM CaCl 2, 40 mg/ml kanamicīna. Kultivēšana fermentatorā tiek veikta 38-39°C temperatūrā, uzturot pH 7±0,15, automātiski titrējot ar 40% nātrija hidroksīda šķīdumu. Izšķīdušā skābekļa koncentrācija piesātinājuma diapazonā (50±10)% tiek uzturēta, mainot maisītāja ātrumu no 100 līdz 800 apgr./min un gaisa padevi no 1 līdz 15 l/min. Substrātu, jo īpaši glikozes un rauga ekstrakta, koncentrācija tiek mērīta fermentācijas laikā, un to koncentrācija tiek uzturēta, mainot koncentrētu šķīdumu padeves ātrumu caur peristaltiskiem sūkņiem, izmantojot gravimetrisko kontrolieri.
Interferona uzkrāšanos nešķīstošās formas veidā uzrauga, izmantojot fāzes kontrasta mikroskopiju, elektroforēzi 15% poliakrilamīda gēlā (SDS-PAAG) un reversās fāzes augstas izšķirtspējas hromatogrāfiju (RF HPLC). Fermentācija tiek pārtraukta, sasniedzot maksimālo optisko blīvumu (~ 25-30 p.u.) un pārtraucot interferona sintēzi. Fermentācijas beigās kultūras šķidrumu atdala, centrifugējot plūsmas rotorā ar griešanās ātrumu 5000-10000 apgr./min. Biomasu iepako plastmasas maisiņos un sasaldē mīnus 70°C temperatūrā.
2. posms. Interferona nešķīstošās formas izolēšana un attīrīšana
300-400 g sasaldētas E. coli SX50 biomasas tiek suspendēti 3000 ml buferšķīdumā 1 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X100). Suspensiju izlaiž caur Gaulin tipa plūsmas homogenizatoru, uztur pie 900 bāriem un centrifugē plūsmas rotorā pie 15 000 apgr./min. Iegūtās nogulsnes secīgi mazgā līdzīgos apstākļos ar buferšķīdumiem 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 3 M urīnviela) un buferšķīdumu 3 (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) un visbeidzot ar interferonu. nogulsnes suspendē 200 ml buferšķīduma 3. Interferona nešķīstošās formas izdalīšanas un attīrīšanas laiks nav ilgāks par 5 stundām.
3. posms. Interferona šķīdināšana un renaturācija
Sauso guanidīna hidrohlorīdu pievieno iepriekšējā posmā iegūtās interferona nešķīstošās formas suspensijai līdz 6 M koncentrācijai, ditiotreitolu pievieno līdz 50 mM, Tris-HCl pH 8,0 līdz 50 mM, NaCl līdz koncentrācijai 50 mM. koncentrācija 150 mM un Triton X100 līdz koncentrācijai 0,1%, inkubēts istabas temperatūrā 2 stundas Neizšķīdušo materiālu atdala, sterilizējot filtrējot caur membrānām ar poru diametru 0,22 mikroni.
Interferona renaturāciju veic, iegūto šķīdumu lēnām 100-200 reizes atšķaidot ar buferšķīdumu 4 (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Pēc tam renaturācijas maisījumu pastāvīgi maisot inkubē 12-15 stundas 4-8°C temperatūrā. Pēc tam pievieno magnija sulfātu līdz 1 mm koncentrācijai, un agregēto materiālu atdala, sterilizējot filtrējot caur membrānfiltru ar poru diametru 0,22 mikroni.
4. posms. Interferona hromatogrāfiskā attīrīšana
Interferona hromatogrāfiskā attīrīšana tiek veikta trīs posmos.
1. Iegūto renaturēto interferonu vispirms attīra ar afinitātes hromatogrāfiju uz Chelatating Sepharose Fast Flow sveķiem (Amersham Biosciences), kas imobilizēti ar Cu +2 joniem. Lai to izdarītu, interferona šķīdumu uzklāj kolonnā ar Cu +2 helātu veidojošo sefarozes ātru plūsmu un interferonu eluē ar 0,1 M citronskābes buferšķīdumu pH 2,2.
2. Otrajā hromatogrāfiskās attīrīšanas posmā interferona šķīdumu uzklāj uz CM Sepharose Fast Flow katjonu apmaiņas sveķiem (Amersham Biosciences) un interferonu eluē ar šķīdumu gradientu (0,0-0,5 M NaCl) 50 mM Na. (CH 3 COO) buferšķīdums, pH 5,5.
3. Interferona monomēra formas attīrīšana no interferona polimēru formu paliekām tiek veikta interferona attīrīšanas trešajā posmā ar gēla filtrēšanu uz Superdex 75 tipa sveķiem (Amersham Biosciences). Hromatogrāfiju veic 50 mM Na(CH3COO) buferšķīdumā, pH 5,0, kas satur 0,15 M NaCl.
Aprakstītā interferona izolēšanas un attīrīšanas metode ļauj iegūt 4-8 g augsti attīrīta interferona vienā izolēšanas ciklā 7-10 dienas no biomasas, kas iegūta no 10 l barotnes. Iegūtā interferona kvalitāte pilnībā atbilst "Eiropas Farmakopejas" prasībām attiecībā uz alfa-2b interferona vielu, proti:
Interferona koncentrācija nav mazāka par 2×10 8 SV/ml;
Interferona īpatnējā aktivitāte nav mazāka par 2,0×10 8 SV/mg;
Zāļu elektroforētiskā tīrība ir ne mazāka par 99% reducējošos un nereducējošos apstākļos, kad želejas ir krāsotas ar sudrabu;
Izolētā interferona izoelektriskais punkts ir pH 5,8-6,3 apgabalā;
Izolētā interferona peptīdu karte būtiski neatšķiras no peptīdu kartes alfa 2b interferona CRS Eiropas standartam;
Kā izriet no iepriekš minētajiem piemēriem, pieprasītā izgudrojumu grupa ļauj iegūt interferonu alfa-2b ar augstu ražu ar salīdzinoši vienkāršu un uzticamu tehnoloģiju.
PRETENZIJA
1. Rekombinantā plazmīda DNS pSX50, kas kodē cilvēka rekombinantā alfa-2b interferona sintēzi, kas raksturīga ar to, ka tās izmērs ir 3218 bāzes pāri (bp) un sastāv no šādiem fragmentiem: secība no 1 līdz 176 nukleotīdiem (n) ietver 176 bp DNS fragments, kas satur triptofāna promotoru (P trp), secība no 177 līdz 194 bp. ietver sintētisku DNS fragmentu 18 bp, kas satur Shine Delgarno sekvenci, kas atbild par translācijas ierosināšanu, secību no 195 līdz 695 bp. ietver 501 bp DNS fragmentu, kas satur interferona alfa-2b gēnu ar nukleotīdu aizvietotājiem: 37 (A>C), 39 (G>T), 40 (A>C), 42 (G>T), 67 (A>C). ), 69 (G>T), 70 (A>C), 72 (A>T), 96 (G>A), 100 (A>C), 102 (A>T), 114 (A>C) , 120 (C>G), 126 (G>A), 129 (G>A), 330 (C>G), 339 (G>A), 342 (G>A), 487 (A> C), 489 (A>T), 495 (G>A), secība no 696 līdz 713 b.p. ietver sintētisku DNS fragmentu 18 bp, kas satur sintētisko polilinkeru, secība no 714 līdz 1138 bp. ietver plazmīdas pKK223-3 DNS fragmentu no 4129 līdz 4553 b.p. 425 bp lielums, kas satur stingrā transkripcijas terminatora rrnBT 1 T 2 secību, secību no 1139 līdz 1229 b.p. ietver pUC19 plazmīdas DNS fragmentu no 2487 līdz 2577 b.p. 91 bp liela, satur β-laktomāzes gēna promotoru (ampicilīna rezistences gēns -Amp R), secība no 1230 līdz 2045 b.p. ietver pUC4K plazmīdas DNS fragmentu ar 720 b.p. līdz mūsu ēras 1535. gadam 816 bp liels, satur kan gēna strukturālo reģionu, secība no 2046 b.p. līdz mūsu ēras 3218. gadam ietver plazmīdas pUC19 DNS fragmentu no 1625 līdz 453 b.p. izmērs 1173 BP, kas satur sekvenci, kas ir atbildīga par plazmīdas (ori) un lac promotora (P lac) replikāciju.
2. Baktēriju celms Eschcerichia coli SX50, kas transformēts ar rekombinanto plazmīdu saskaņā ar 1. punktu, ir rekombinantā cilvēka leikocītu interferona alfa-2b ražotājs.
3. Paņēmiens cilvēka alfa-2b interferona iegūšanai, kas ietver Escherichia coli SX5 celma saskaņā ar 2. punktu kultivēšanu barotnē ar pastāvīgu barības vielu substrātu pievienošanu biosintēzes laikā, mikroorganismu šūnu mehānisku iznīcināšanu 700-900 bāru spiedienā. , interferona šķīdināšana guanidīna hidrohlorīda buferšķīdumā , interferona renaturēšana fizioloģiskos buferšķīdumos haotropu aģentu klātbūtnē, interferona trīspakāpju hromatogrāfiska attīrīšana uz sveķiem, piemēram, helātu sefarozes ātrās plūsmas, kas imobilizēta ar Cu +2 joniem, jonu apmaiņas hromatogrāfija. uz jonu apmaiņas sveķiem, piemēram, CM Sepharose Fast Flow un izmēra izslēgšanas hromatogrāfija uz sveķiem, piemēram, Superdex 75.
4. Paņēmiens saskaņā ar 3. punktu, kas atšķiras ar to, ka kultivēšanu veic uz barotnes ar samazinātu triptofāna saturu, nepārtraukti pievienojot uzturvielu substrātus, vislabāk glikozi un rauga ekstraktu.
5. Paņēmiens saskaņā ar 3. punktu, kurā pirms interferona šķīdināšanas to attīra, atdalot šķīstošos šūnu komponentus, ieskaitot DNS, RNS, proteīnus, lipopolisaharīdus, mazgājot ar buferšķīdumiem, kas satur mazgāšanas līdzekļus, piemēram, Triton XI 00, urīnvielas.
6. Metode saskaņā ar 3. punktu, kurā pēc katras hromatogrāfiskās attīrīšanas tiek veikta sterilizējošā filtrēšana caur filtriem ar poru izmēru 0,22 μm.