ИММУНОПРОФИЛАКТИКА КОРИ Для иммунопрофилактики применяется живая ослабленная вакцина. Вводят ее подкожно, под лопатку. При проведении вакцинации против кори, эпидемического паротита и краснухи используют моновакцины или тривакцины (корь, краснуха и эпидемический

ИММУНОПРОФИЛАКТИКА ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ПАРОТИТА Вакцинация проводится ослабленной живой вакциной, которую вводят подкожно, под лопатку.К противопоказаниям проведения вакцинации против эпидемического паротита относятся иммунодефицитные состояния, злокачественные

ИММУНОПРОФИЛАКТИКА КРАСНУХИ В России вакцинация проводится зарубежными препаратами «Рудивакс» фирмы «Авентис Пастер» (Франция), «Приорикс» фирмы «Глаксо Смит Кляйн» (Англия, Россия), М-М– R II, фирмы «Мерк Шарп и Доум (США). Прививка вводится подкожно или внутримышечно.

ИММУНОПРОФИЛАКТИКА ГЕПАТИТА В Вирусный гепатит В относится к наиболее опасным возбудителям, приводящим к развитию хронического гепатита, цирроза и первичного рака печени. У новорожденных детей основную роль в передаче вируса играет его передача от

ЛЕКЦИЯ № 9. Иммунопрофилактика Введение средств активной иммунизации в практику детского здравоохранения обусловило значительное снижение заболеваемости детей инфекционными болезнями. В настоящее время проводятся прививки против туберкулеза, дифтерии, столбняка,

Специфическая иммунопрофилактика Модель иммунной системы человека совершенна. Своей целесообразностью и надежностью она восхищала всех, кто когда-либо исследовал ее. К сожалению, за последнее столетие иммунитет у человечества явно снизился. Об этом свидетельствует

Неспецифическая иммунопрофилактика Методов неспецифической профилактики болезней очень много, поскольку они представляют собой совокупность методов стимуляции скрытых резервов защитных сил организма, их совершенствования, гибкости, универсальности, получивших

Для определения резус-фактора применяются два метода:

а) определение резус-фактора с помощью универсального реагента;

б) определение резус-фактора цоликлоном анти-Д супер.

Определение резус-фактора универсальным реагентом

Оснащение: специально приготовленный универсальный реагент антирезус (Д), стандартные резусположительные и резусотрицательные эритроциты для контроля, пробирки, пипетки Пастера, изотонический раствор хлорида натрия.

Для определения резус-фактора может быть использована свежая несвернувшаяся кровь, взятая из пальца непосредственно перед исследованием или консервированная без всякой предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после образования сгустка и отстаивания сыворотки.

Техника определения: на дно пробирки внести 1 каплю стандартного реагента антирезус и 1 каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Содержимое пробирки перемешать встряхиванием и затем медленно поворачивать, наклоняя пробирку почти до горизонтали таким образом, чтобы содержимое растекалось по её стенкам. Такое размазывание крови по стенкам пробирки делает реакцию более выраженной. Как правило, агглютинация наступает в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса антиген+антитело и чётко выраженной агглютинации, а также ввиду возможности замедленной реакции при слабо выраженной агглютинабельности эритроцитов, контакт эритроцитов с реагентом при повёртывании пробирки следует проводить не менее трех минут. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 5-8 мл изотонического раствора хлорида натрия и перемешивают, не взбалтывая, путем 2-3-кратного перевертывания пробирки. Оценку производят визуально.

Одновременно с исследованием крови больных или доноров производят контрольное исследование стандартных резусположительных эритроцитов той же группы и стандартных резусотрицательных эритроцитов, обязательно одногруппных с исследуемой кровью.

Оценка результатов: наличие агглютинации в виде крупных хлопьев из эритроцитов на фоне просветленной жидкости указывает на резусположительную принадлежность исследуемой крови (Rh+).

Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная жидкость) указывает на резусотрицательную принадлежность исследуемой крови (Rh-).

Результат учитывается как истинный после проверки контрольных образцов, то есть при положительном результате со стандартными резусположительными эритроцитами и отсутствии агглютинации со стандартными резусотрицательными эритроцитами, одногруппными с исследуемой кровью по системе АВО.

Определение резус-фактора цоликлоном анти-Д СУПЕР

Действующим началом цоликлона анти-Д СУПЕР являются моноклональные человеческие анти-Д антитела, которые продуцируются гетерогибридной, полученной в результате слияния человеческой лимфобластоидной линии и миеломной клеточной линии мыши. Реагент лишен патогенных вирусов (гепатит, СПИД). Анти-Д СУПЕР специфичен по фактору Rh, поэтому может использоваться для выявления Д-антигена в эритроцитах любой группы крови. Анти-Д СУПЕР выпускается в жидкой форме во флаконах объёмом 5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). В качестве консерванта применяется 0,1 % раствор азида натрия. Срок хранения 1 год при температуре +2 0 С - +8 0 С. вскрытый флакон можно хранить в холодильнике в течение месяца в закрытом виде.

Определение Д-антигена производится в крови, взятой из пальца или из вены.

А) Определение на плоскости.

На пластинку наносят около 0,1 мл реагента, рядом маленькую каплю исследуемой крови (0,01 мл) и капли смешивают. Реакция агглютинации начинает появляться через 60 сек. Результат читают через 3 минуты. Если произошла реакция агглютинации – кровь резусположительная, если нет – резусотрицательная.

Б) Определение в пробирке. В пробирку вносят 2 капли реагента и 1 каплю 5 % взвеси исследуемых эритроцитов в изотоническом растворе хлорида натрия. Содержимое пробирки тщательно перемешивают встряхиванием и инкубируют 30-45 минут при комнатной температуре. Пробирку центрифугируют при 1500-2000об/мин в течение 1 минуты, затем, покачивая пробирку, определяют агглютинацию – макро- и микроскопически.

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Наиболее иммуногенным из 5 основных антигенов группы крови системы резус (табл. 18.3) является антиген D. Распространенность антигена D у населения Российской Федерации - 86% (доля резус-отрицательных лиц, соответственно, около 14%). Иммуногенность других (минорных) антигенов системы резус существенно ниже и убывает в следующем ряду: с > Е > С > е.

Иммунная система резус-отрицательных лиц при контакте с антигеном D синтезирует анти-D-антитела, что клинически важно при аллогенных гемотрансфузиях и беременности резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом (посттрансфузионные гемолитические реакции и гемолитическая болезнь новорожденных, соответственно). В зависимости от гаплотипа на мембране эритроцитов обычно экспрессировано 10000-30000 молекул D, а в некоторых случаях и более.

Существует две особые категории D-позитивных лиц, способных образовывать анти-D-антитела.

• Первая - лица, эритроциты которых характеризуются значительно сниженной экспрессией нормального D на мембране, порядка 100-500 молекул на клетку, "слабый" D (D weak). Референтным методом выявления слабого D является непрямой антиглобулиновый тест.
• Вторая - лица, эритроциты которых характеризуются экспрессией измененного D (частичный D, D partial). Предполагается, что белковая молекула D имеет четыре частично перекрывающихся эпитопа: W, X, Y и Z. В редких случаях имеет место недостаток одного или нескольких эпитопов, соответственно, иммунная система лиц с частичным D способна вырабатывать антитела к отсутствующим эпитопам.

По современной классификации, лица с частичным D, способные вырабатывать анти-D-антитела, подразделяются на семь категорий. Наибольшую частоту встречаемости и практическое значение имеет категория VI, эритроциты которой несут только эпитоп Z. Лица категории VI могут вырабатывать антитела к неизмененному D и частичному D всех остальных категорий. Современный подход к выявлению частичного D категории VI предполагает исследование резус-принадлежности с использованием двух реагентов: моноклональных анти-D-антител класса IgМ и поликлональных анти-D-антител класса IgG (либо моноклональных анти-D-антител класса IgG).

Для удобства в повседневной работе иммуногематологических лабораторий слабые варианты антигена D объединяют в группу D u , частота которой составляет около 1%. Эти эритроциты слабо или вообще не агглютинируются полными анти-резус антителами в реакции прямой агглютинации.

Регламентированным является способ определения резус-принадлежности с использованием стандартного универсального реагента антирезус Rh0(D), первично отрицательные образцы дополнительно исследуются с использованием стандартного универсального реагента анти-Rh0" (DС) и со стандартной сывороткой Rh0-(DСЕ). Резус-отрицательными считают доноров, кровь которых не содержит ни одного из этих трех антигенов (D, С, Е). Указанный способ эффективно и широко использовался до разработки диагностикумов на основе моноклональных антител.

Более обоснованным представляется двух-этапный способ определения резус-принадлежности крови. На первом этапе используют цоликлон "Анти-D-супер" (моноклональные анти-D-антитела класса IgМ). На втором этапе резус-принадлежность определяют в пробирке, применяя стандартный универсальный реагент для определения резус-фактора Rh0(D), либо в желатиновом тесте с использованием цоликлона "Анти-D" (моноклональные анти-D-антитела класса IgG). Сочетание отрицательного результата на первом этапе и положительного - на втором является признаком частичного D, наиболее вероятно - категории VI.

В большинстве (порядка 90%) случаев для частичного D категории VI характерен генотип СсDее. С помощью высокоспецифичных моноклональных антител устанавливается гетерогенность частичного D категории VI.

Реципиенты, содержащие антиген D u , должны быть отнесены к резус-отрицательным и им должна быть перелита только резус-отрицательная кровь, так как нормальный антиген D может вызвать у таких лиц иммунный ответ.

Лица с антигеном D u квалифицируются как резус-положительные доноры, так как переливание их крови может вызвать иммунный ответ у резус-отрицательных реципиентов, а в случае предшествующей сенсибилизации к антигену D - тяжелые трансфузионные реакции. Поэтому кровь доноров следует обязательно тестировать на присутствие D u .

Беременным женщинам с частичным D категории VI, когда ожидается рождение ребенка с полным D, целесообразно назначение антирезусного иммуноглобулина.

Резус-принадлежность крови больных устанавливают по наличию или отсутствию антигена D. Во избежание ошибки процедуру взятия крови и определение резус-принадлежности проводят дважды. Определение минорных антигенов системы резус, как правило, производится при необходимости многократных трансфузий в тех случаях, когда в сыворотке реципиента обнаружены антитела к антигенам системы резус, а также у беременных женщин.

Результат определения резус-принадлежности крови больных регистрируется в специальном журнале и на бланке с указанием даты и за подписью врача, проводившего определение. Этот бланк вклеивается в историю болезни с указанием даты и подписью лечащего врача.

Результат определения резус-принадлежности крови доноров регистрируется в специальном журнале и в донорской карте с указанием даты и за подписью врача, проводившего определение.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ

Реакция гемагглютинации на плоскости с помощью анти-D IgМ (полные антитела) моноклонального реагента

Определение производят в нативной крови, стабилизированной с помощью консервантов; в крови без антикоагулянта, в т. ч. взятой из пальца. Наиболее четкая реакция агглютинации наблюдается при использовании высокой концентрации эритроцитов и температуре около +37°С, поэтому желательно использовать подогретую пластинку.

Ход определения:

• на пластинку со смачиваемой поверхностью наносят большую каплю (около 0,1 мл) реагента;
• рядом помещают маленькую каплю (0,01-0,05 мл) исследуемой крови;
• смешивают кровь с реагентом стеклянной палочкой;
• через 10-15 с покачивают пластинку в течение 20-30 с;
• реакция агглютинации начинает развиваться через 10-15 с, четко выраженная крупнолепестковая агглютинация наступает через 30-60 с. Результат агглютинации следует учитывать через 3 мин, поскольку с эритроцитами, несущими антиген D u , реакция агглютинации происходит медленнее.

  Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии в исследуемых эритроцитах антигена D (кровь - резус-положительная). Отсутствие агглютинации свидетельствует о том, что исследуемые эритроциты не содержат антигена D (кровь - резус-отрицательная). В случае слабой агглютинации делают предположение о наличии на эритроцитах слабого антигена D и проводят исследование фенотипа эритроцитов в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямой пробе Кумбса) с использованием IgG (неполных) анти-D-антител.

• сразу же после определения записывают результаты реакции.

Определение слабых форм антигена D (D u) на втором этапе исследования реакцией конглютинации с желатином в пробирочном тесте с помощью анти-D IgG (неполные антитела) моноклонального реагента

Параллельно с исследованием осуществляют постановку трех контрольных проб:

• а) со стандартными резус-положительными эритроцитами;
• б) со стандартными резус-отрицательными эритроцитами;
• в) с исследуемыми эритроцитами и раствором желатина, но без анти-D-антител.

Ход определения:

• в пробирку вносят одну каплю (0,05 мл) свободных эритроцитов из сгустка свернувшейся крови или эритроцитов, отмытых от консерванта;
• добавляют 2 капли (0,1 мл) 10% желатина, предварительно прогретого при 45-50°С до разжижения;
• добавляют одну каплю реагента анти-В;
• перемешивают суспензию;
• инкубируют 10-15 мин в водяной бане или 30 мин в термостате при 48°С;
• прибавляют 5-6 мл физиологического раствора;
• осторожно переворачивают пробирку 1 - 2 раза;
• визуально (невооруженным глазом или используя лупу) определяют наличие агглютинатов.

Агглютинация эритроцитов свидетельствует о присутствии в них антигена D. В случае четкой агглютинации в образце крови, резус-отрицательной по результатам исследования с помощью анти-D IgМ моноклональных антител, делают заключение о наличии антигена D u . В случае нечеткой мелкопесочной агглютинации кровь необходимо тестировать в непрямом антиглобулиновом тесте.

Аналогичным образом наряду с моноклональными реагентами можно использовать стандартные аллоиммунные сыворотки с неполными анти-D-антителами.

При наличии неадекватных результатов контрольных проб определение резус-принадлежности следует повторить с использованием других реагентов или образца желатина. При агглютинации исследуемых эритроцитов желатином в отсутствие анти-D-антител можно предположить наличие на эритроцитах адсорбированных антиэритроцитарных антител анти-резус или иной специфичности.

Определение резус-антигенов с помощью универсальных реагентов

Стандартный реагент антирезус Rh0(О) содержит поликлональные неполные анти-D-антитела. Одновременно с исследованием крови доноров производится контрольное исследование стандартных резус-положительных эритроцитов той же группы или группы 0(I) и стандартных резус-отрицательных эритроцитов обязательно одногруппных с исследуемой кровью.

Ход определения:

• на дно пробирки вносят 1 каплю стандартного реагента антнрезус;
• добавляют каплю исследуемой крови (или эритроцитов);
• содержимое пробирки перемешивают встряхиванием;
• медленно поворачивают пробирку, наклоняя ее почти до горизонтали таким образом, чтобы содержимое растекалось по стенкам. Такое распределение крови по стенкам пробирки делает реакцию более выраженной;
• агглютинация наступает в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса антиген-антитело и четко выраженной агглютинации, а также ввиду возможности замедленной реакции при наличии антигена D u , контакт эритроцитов с реагентом при перевертывании следует проводить не менее 3 мин;
• для исключении неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического раствора и перемешивают, не взбалтывая, путем 2-3 -кратного перевертывания пробирки;
• оценку производят визуально.

Наличие агглютинации в виде крупных хлопьев из эритроцитов на фоне просветленной жидкости свидетельствует о резус-положительной принадлежности исследуемой крови.

Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная жидкость) - признак резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови.

Результат учитывается как истинный после проверки контрольных образцов, то есть при положительном результате со стандартными резус-положительными эритроцитами и отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, одногруппными с исследуемой кровью по системе АВО.

Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса) с помощью (неполных) анти-D-антител

Параллельно с исследованием образцов тестируемой крови проводят контрольное исследование со стандартными резус-отрицательными эритроцитами.

Ход определения:

• из исследуемой крови готовят 2-5% взвесь отмытых эритроцитов. С этой целью вносят в пробирку 5 капель (около 0,25 мл) исследуемой крови, три раза отмывают в 5-10 мл физиологического раствора; ресуспендируют осадок эритроцитов в 2-3 мл физиологического раствора или, что предпочтительнее, в 2-3 мл раствора низкой ионной силы - РНИС (в этом случае произойдет более прочная и быстрая фиксация антител на эритроцитах);
• маркируют чистую пробирку;
• вносят в нее 1 каплю реагента анти-D;
• добавляют 1 каплю 2-5% взвеси исследуемых эритроцитов;
• если эритроциты суспендированы в физиологическом растворе - инкубируют смесь при 37°С в течение 30-45 мин; если используют эритроциты в РНИС - 10-15 мин;
• отмывают эритроциты, используя 5-10 мл физиологического раствора: при использовании моноклональных анти-D-антител - однократное отмывание, а при использовании поликлональных анти-D-антител - трехкратное. Следует иметь в виду, что сыворотка крови в разведении 1:4000 инактивирует равный объем антиглобулинового реагента, следовательно недостаточное отмывание может привести к инактивации антиглобулинового реагента и ложноотрицательному результату теста;
• удаляют физиологический раствор;
• добавляют 1 каплю антиглобулинового реагента к осадку эритроцитов и тщательно перемешивают;
• центрифугируют 15-20 с при 2000-3000 об./мин (900-1000 g);
• аккуратно ресуспендируют осадок эритроцитов и визуально определяют наличие или отсутствие агглютинации. При наличии агглютинации кровь является резус-положительной. При отсутствии агглютинации - резус-отрицательной. Слабая агглютинация возможна при экспрессии антигена D u ;
• записывают результаты исследования.

Агглютинация эритроцитов, обработанных протеолитическими ферментами, IgG (неполными) анти-D-антителами

Для усиления прямой агглютинации эритроцитов в солевой среде используют предварительную обработку эритроцитов протеазами (протеолитическими ферментами): бромелином, папайном, трипсином и др. При этом повышается чувствительность метода, в том числе и в отношении слабых форм антигена D. Метод используется в системах автоматизированного определения групп крови. Особенностью этого теста, затрудняющей его применение для рутинного фенотипирования эритроцитов, является феномен прозоны - ингибирование агглютинации избыточным количеством антител. Для избежания феномена прозоны необходимо обеспечить стандартность обработки эритроцитов ферментами и строго соблюдать концентрацию анти-D-антител,- рекомендованную производителем.

Содержимое (Table of Contents)

ОФС.1.8.2.0004.15 Испытание на анти-D антитела в лекарственных препаратах иммуноглобулинах человека

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод определения анти-D антител в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека. Анти-D антитела определяют методом гемагглютинации «на плоскости» (Метод А) или в геле (Метод В).

Принцип метода состоит в том, что содержащиеся в испытуемом препарате анти-D антитела, являясь иммуноглобулинами класса G, способны вызывать агглютинацию D-положительных эритроцитов.

Проведение испытания

Для контроля специфичности анализа применяют D-отрицательные эритроциты фенотипа 0rr.

Допустимо применение как свежеприготовленной суспензии эритроцитов (при испытаниях методом гемагглютинации «на плоскости», Метод А), так и стандартных эритроцитов, входящих в тест-наборы (Методы А и В). При определении содержания анти-D-антител Методом А используют 3% суспензию эритроцитов, при определении содержания гемагглютининов гелевым методом (Метод В) используют 0,8% суспензию эритроцитов.

Метод гемагглютинации «на плоскости» (Метод А)

В стеклянные пробирки или лунки планшета вносят равное количество соответствующего разведения препарата и 3% суспензии D-положительных эритроцитов человека группы крови I (0) — первый ряд и 3% суспензии D-отрицательных эритроцитов человека группы крови I (0) — второй ряд. К подготовленному разведению стандартного образца также добавляют равное количество 3% суспензии D-положительных эритроцитов человека группы крови 0 (первый ряд) и 3% суспензии D-отрицательных эритроцитов человека группы крови 0 (второй ряд). Пробы осторожно встряхивают (на шейкере) в течение 10 сек, затем центрифугируют в течение 1 мин при 80 об/мин. Пробирки (планшеты) располагают под углом 70° к горизонтальной поверхности и оценивают визуально агглютинацию эритроцитов через 4 – 5 мин (но не более чем через 10 мин).

Метод гемагглютинации в геле (Метод В)

Гелевый метод основан на использовании гелевой карты, представляющей собой пластиковый планшет с микропробирками, наполненными гелевыми колонками. Каждая микропробирка состоит из дозирующей/инкубационной камеры и колонки, содержащей полимеризованные микросферы декстрана в буферном растворе низкой ионной силы (LISS).

В дозирующую/инкубационную камеру микропробирки вносят по 1 капле 0,8 % суспензии стандартных D-положительных эритроцитов человека группы крови 0 (первый ряд) или по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-отрицательных эритроцитов человека группы крови 0 (второй ряд) и по 25,0 мкл соответствующего разведения испытуемого образца. Одновременно готовят пробы положительного и отрицательного стандартных образцов содержания анти-D антител: в дозирующую/инкубационную камеру микропробирки вносят по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-положительных эритроцитов человека группы крови 0 (первый ряд) или по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-отрицательных эритроцитов человека группы крови 0 (второй ряд) и по 25,0 мкл соответствующего разведения стандартного образца. Пробы инкубируют при температуре (37±0,5)°С в течение 30 мин. По окончании инкубации пробы центрифугируют (на специальной центрифуге для гелевых карт) в стандартных условиях (запрограммированный режим) и оценивают агглютинацию. Агглютинированные эритроциты распределяются в толще гелевой колонки или в ее верхней части. Неагглютинированные эритроциты оседают на дно микропробирки.

Критерии приемлемости результатов:

— в пробирках (планшетах, микропробирках), содержащих суспензию D-отрицательных эритроцитов человека, агглютинация должна отсутствовать. Наличие агглютинации в этих пробирках (планшетах, микропробирках) свидетельствует о неспецифической реакции; испытания в этом случае необходимо повторить;

Примечания

1. Подготовка испытуемого образца. Испытуемый образец разводят фосфатным буферным раствором (рН 7,4±0,1), содержащим 2 г/л бычьего сывороточного альбумина, до содержания белка в образце 25 г/л. Это разведение испытуемого образца принимают за двукратное разведение (1:2), даже если оно и не соответствует истинной кратности разведения.

Готовят два ряда двукратных разведений испытуемого образца с использованием фосфатного буферного раствора (рН 7,4±0,1), содержащего 2 г/л бычьего сывороточного альбумина (1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256). При использовании гелевого метода (Метод В) разведения испытуемого образца готовят с использованием 0,9% раствора натрия хлорида или буферного раствора низкой ионной силы (LISS).

1. Подготовка стандартных образцов содержания анти- D антител . В качестве стандартных образцов используют 5% раствор иммуноглобулина человека, содержащий 0,0475 МЕ/мл анти-D антител и имеющий номинальный титр в реакции гемагглютинации 1:8 (положительный стандартный образец) и 5% раствор иммуноглобулина человека, содержащий анти-D антитела в разведении не более 1:2 (отрицательный стандартный образец). Содержание анти-D антител в положительном стандартном образце является максимально допустимым для препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения. Подготовку стандартных образцов проводят в соответствии с инструкцией по применению. Анализ проводят с образцами, разведенными фосфатным буферным раствором (рН 7,4±0,1), содержащим 2 г/л бычьего сывороточного альбумина, до содержания белка 25 г/л.
2. Подготовка раствора папаина. Лиофилизат папаина растворяют в соответствии с инструкцией производителя. Инкубируют при температуре (37±0,5) 0 С в течение 10–15 мин. Раствор используют свежеприготовленным. Возможно хранение раствора при температуре(6±2) 0 С в течение 5 сут или при температуре минус (21±1)°С в течение 6 мес. Раствор после оттаивания повторному замораживанию не подлежит.
3. Подготовка суспензии стандартных эритроцитов. Свежеприготовленные D-положительные эритроциты (хранившиеся не более 3 сут), полученные не менее чем от 3 доноров, центрифугируют в течение 10 мин при 1500–2000 об/мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют в десятикратном объеме фосфатного буферного раствора и центрифугируют 10 мин при тех же условиях. Процедуру повторяют не менее 3 раз, до получения прозрачной надосадочной жидкости.

В стеклянную пробирку вносят равные объемы промытых эритроцитов и раствора папаина, инкубируют в течение 15 мин при температуре (37±0,5) 0 С, а затем центрифугируют при 1500–2000 об/мин в течение 10 мин. После удаления надосадочной жидкости осадок ресуспендируют в десятикратном объеме фосфатного буферного раствора и центрифугируют при тех же условиях.

Для приготовления 3% суспензии 1 объем осадка папаинизированных эритроцитов ресуспендируют в 32 объемах фосфатного буферного раствора, содержащего 2 г/л бычего сывороточного альбумина.

Аналогичным образом приготавливают 3% суспензию D-отрицательных эритроцитов, полученных от 1-3 доноров.

1. Приготовление фосфатного буферного раствора. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 8,0 г натрия хлорида, 0,76 г безводного натрия гидрофосфата, 0,2 г калия хлорида, 0,2 калия дигидрофосфата. Добавляют 900 мл воды очищенной. Доводят рН до 7,4±0,1 1М раствором натрия гироксида или 1 М раствором хлористоводородной кислоты, перемешивают, доводят объем раствора до метки водой очищенной и вновь перемешивают.