Под лабораторными животными понимаются любые позвоночные, которые применяются для научных исследований, обучения или испытаний. Условно их делят на традиционные, т. е. наиболее часто используемые в экспериментах, и нетрадиционные, которые нечасто используются в биомедицинских исследованиях. К традиционным относятся лабораторные мыши, крысы, кролики, морские свинки, хомяки, кошки, собаки, обезьяны и др. К нетрадиционным - песчанки, суслики, рыбы, опоссумы, броненосцы и др.
Зоогигиенические требования к устройству вивария. Помещение, где под контролем специалистов лабораторного животноводства осуществляется содержание, размножение животных, используемых для экспериментальных (научных) или учебных целей, а также для практики здравоохранения, называют виварием (от лат. \ivus - живой).
Выбор технологии содержания и разведения лабораторных животных, а также планирование и проектирование помещений для животных определяется микробиологической категорией (статусом) животных.
Помещения, предназначенные для содержания животных, должны обеспечивать им нормальную жизнедеятельность. Любые отклонения от нормы в среде, окружающей животное, немедленно сказываются на его внутреннем состоянии. Ого неизбежно приводит к искажению результатов научных исследований.
Таким образом, требования, предъявляемые к помещениям для животных, теснейшим образом связаны с получением объективных (достоверных) результатов экспериментов и их воспроизводимости в будущем.
Правильно спроектироваяный, хорошо сконструированный, построенный и содержащийся в должном состоянии виварий составляет важный элемент правильного содержания и использования животных и облегчает эффективную, экономичную и безопасную эксплуатацию. Конструкция и размер вивария определяются масштабом исследовательской работы с животными в данном научном учреждении, видом содержащихся в нем животных, расположением вивария по отношению к другим здания» и географической зоной, где оно находится.
Необходимым требованием обеспечения правильного содержания животных и охраны здоровья обслуживающего персонала является отделение помещений, где содержатся животные, от служебных помещений.
Продуманное планирование позволяет разместить виварий рядом или вблизи с научно-исследовательской лаборатори-

1 - помещение для приема животных; 2 - гсмеще- ние для приемного контроля животных; 3 - поие- щение для наблюдения животных; 4 - административное и вспомогательное помещение: 5 - раздевалка; 6 - санузел; 7 - чистый коридор; 8 - склад 9 - «предпроцедурное» помещение; 10 - помещение для содержания животных: 11 - запасное подготовительное помещение; 12 - помещение для койки; 13 - машинное помещение; 14- помещение для сжигания отходов; 15 - грязный коридор; 1Б- помещение для стерилизадии.

ей, разделив их барьерами типа тамбура, коридора или этажа. Виварий должен состоять из: 1) помещения для приема животных; 2) карантинного отделения;

1. комнат для содержания животных;
2. манипуляционной; 5) операционной; 6) ветеринарно-диагностического кабинета и других вспомогательных служб.

Примерная схема типового биологического корпуса (вивария) представлена на рис. 54.
В виварии обеспечивают изоляцию поступивших и находящихся в карантине и в изоляторе животных, изоляцию чистых» и «грязных» потоков, естественное и искусственное освещение, отопление, непрерывную вентиляцию, снабжение холодной и горячей водой, канализацией.
При выборе строительных материалов предпочтение следует отдавать наиболее эффективным и облегчающим уборку помещений. Для отделки внутренних поверхностей необходимо использовать прочные, водоотталкивающие, огнестойкие и бесшовные материалы. Поверхности должны быть высокоустойчивы к действию чистящих механических и химических средств, обработке струей воды под давлением и к ударам. При покрытии поверхностей, с которыми могут соприкасаться животные, краской и плиткой, нужно предусмотреть использование нетоксических материалов. При строительстве сооружений на открытом воздухе следует применять материалы, устойчивые к атмосферным воздействиям и легко поддающиеся уборке.
Коридоры должны быть достаточно широкими для беспрепятственного прохода персонала и доставки оборудования. Для большинства сооружений рекомендуются коридоры шириной 1,8-2,4 м.
По соображениям безопасности двери должны открываться внутрь помещения, где содержатся животные; однако, если возникнет необходимость открывания дверей в коридор, нужно предусмотреть сооружение тамбура. С точки зрения безопасности и других причин предпочтение следует отдавать дверям со смотровыми окнами. Двери должны быть достаточно большими (приблизительно 105 х 210 см), чтобы обеспечить свободный доступ для кормушек и оборудования.
Если необходимо или желательно ограничить доступ в какие-то помещения (например, при использовании опасных веществ), двери следует оборудовать замками. При этом конструкция дверей должна предусматривать возможность их открывания изнутри без ключа.
Полы должны быть водоотталкивающими, неабсорбирующими, устойчивыми к ударным воздействиям и сравнительно гладкими.
Стены должны быть гладкими, водоотталкивающими, неабсорбирующими и резистентными к ударам. В них не должно быть трещин, незаделанных отверстий, через которые проходят коммуникации, или плохо заделанных стыков с дверьми, потолками, полами и углами. Материалы, которыми покрыты поверхности стен, должны быть достаточно стойкими и выдерживать обработку детергентами и дезинфицирующими препаратами, а также водой под мощным давлением.
Потолки должны быть гладкими, водонепроницаемыми и не иметь дефектных стыков. Материалы, которыми покрыты потолки, должны выдерживать обработку моющими и дезинфицирующими препаратами. Потолки, покрытые штукатуркой или огнестойкой сухой штукатуркой, должны быть обработаны уплотняющим материалом и окрашены моющейся краской. Потолки, образуемые бетонным полом верхнего этажа, считаются приемлемыми, если они гладкие, обработаны уплотняющими прокладками и покрашены.
Помещения для обработки или хранения кормов или их ингредиентов должны содержаться в чистоте и быть защищены от проникновения вредителей. Корма следует хранить не на полу, а на поддонах, полках или тележках.
Конструкция и размещение кормушек должны обеспечивать удобный доступ к корму и сводить до минимума возможность его загрязнения мочой и фекалиями. В обычных условиях животные должны иметь свободный доступ к чистой питьевой воде в соответствии с их индивидуальными потребностями.
Подстилка для животного является контролируемым фактором окружающей среды, который может влиять как на экспериментальные данные, так и на состояние животного. Чтобы обеспечить сохранность качества и свести до минимума возможность контаминации подстилочных материалов, их следует транспортировать и хранить не на полу, а на поддонах, полках или тележках. Частота и интенсивность проведения уборки и дезинфекции зависят от требований, предъявляемых к здоровой среде обитания животного с учетом его нормального поведения и физиологических характеристик.
Частота санитарной обработки клеток, стеллажей и вспомогательного оборудования определяется типом используемых клеток и принятыми методами ухода за животными, включающими регулярную ручную или автоматическую смену подстилки и регулярное промывание струей воды поддонов. Клетки и сопутствующее оборудование должны подвергаться санитарной обработке не реже одного раза в две недели. Клетки со сплошным полом, бутыли с водой и трубки-поилки обычно требуют санитарной обработки, по крайней мере, раз в неделю.
Дезинфекция оказывается достаточно эффективной при мойке и ополаскивании водой, нагретой до 60-80°С или выше.
Инвентарь, используемый при уборке, должен быть закреплен за определенными

помещениями, и его не следует переносить из одного помещения в другое. Сам инвентарь следует регулярно чистить; причем он должен быть изготовлен из коррозионно-устойчивых материалов.
Профилактика заболеваний является важнейшим элементом ветеринарного обеспечения животных. Эффективные программы профилактических мероприятий способствуют повышению научной ценности животных, поскольку они позволяют сохранить их здоровье и свести до минимума вероятность изменения их состояния, обусловленную заболеваниями. Программы профилактических мероприятий включают различные комбинации правил, процедур и методов, связанных с карантином и стабилизацией здоровья животных, а также с раздельным содержанием животных в зависимости от вида, источника поступления и состояния здоровья.
Карантин предполагает содержание вновь поступивших животных отдельно от животных, уже находящихся в виварии, до полного определения состояния здоровья и, возможно, микрофлоры вновь поступивших животных.
К раздельному содержанию животных одного и того же вида можно прибегать в тех случаях, когда животные, поступившие из разных центров или источников, являются носителями различных патогенных микроорганизмов (Сидорчук А. А., Глушков А. А., 2002).
После карантина (мыши, крысы - 10 суток, собаки - 30 суток, остальные животные - 21 сутки) животных маркируют (мышей и крыс - окраской, кроликов - надеванием на ухо бирки с номером, птиц - кольцеванием), осматривают, взвешивают, замеряют температуру, частоту дыхания, пульс. Если отклонения от нормы отсутствуют, животное берут в опыт и переводят в специальное помещение. Вышедших из опыта животных подвергают безболезненному умерщвлению (эвтаназии). Мелких животных умерщвляют декапитацией или ингаляцией хлороформа (эфира), кроликов - воздушной эмболией, крупных животных - электрическим током.
Оборудование вивария и микроклимат. Кондиционирование воздуха является эффективным средством регулирования температуры и влажности воздуха. Конструкция систем обогрева, вентиляции и кондиционирования воздуха должна обеспечивать их надежность, удобство эксплуатации и экономию электроэнергии.
Относительная влажность обычно поддерживается в пределах 30-70% в течение всего года. На случай частичного отказа системы обогрева, вентиляции и кондиционирования воздуха необходимо предусмотреть аварийную систему, которая обеспечила бы поддержание уровней температуры и влажности в приемлемом диапазоне.
В некоторых случаях рекомендуется использование фильтров для очистки воздуха, поступающего в помещения для содержания животных, проведения экспериментальных процедур и хирургических манипуляций.
Электрическая система должна быть безопасной и обеспечивать адекватное освещение, иметь достаточное количество розеток и гарантировать достаточную силу тока для специального оборудования. На случай отключения электричества необходимо предусмотреть альтернативный или аварийный источник электроэнергии для обеспечения функционирования критически важных систем или вспомогательных систем (например, морозильников, вентилируемых стеллажей и изоляторов) в помещениях для животных, операционных блоках и других важных зонах.
Зоны для хранения отходов должны быть отделены от других хранилищ. Для хранения трупов животных и их тканей обязательно иметь холодное помещение
С холодильнии камерии, отделенное нт других холодных комнат; в таком помещении температура не должна превышать 7°С, чтобы исключить возможность разложения отходов и трупов животных.
При эксплуатации вивария большое значение имеет регулирование уровня шума. В отношении защиты от шума кирпичные стены представляются более эффективными, чем металлические или гипсовые, поскольку благодаря своей плотности они обладают меньшей звукопроницаемостью. В некоторых ситуациях с целью уменьшения уровня шума можно использовать поддающиеся обработке звукоизолирующие материалы, прикрепляемые к стенам или потолкам. Определенное внимание следует уделить снижению уровня шума, генерируемого работающей аппаратурой, особенно в ультразвуковом диапазоне.
В виварии необходимо предусмотреть специальную единую зону для санитарной обработки клеток и вспомогательного оборудования. Обычно для мойки клеток рекомендуется использовать механические моечЕые машины, которые следует выбирать с учетом типа клеток и другого оборудования.
Первичное ограждение (обычно клетка, загон или стойло) ограничивает непосредственную среду обитания животного. Приемлемые первичные ограждения:

• удовлетворяют нормальным физиологическим и поведенческим потребностям животного, включая мочеиспускание и дефекацию, поддержание температуры тела, нормального характера движений и поз, а также, по показаниям, размножение;
• обеспечивают социальные взаимоотношения и установку иерархических отношений внутри или между ограждениями;
• дают возможность животным оставаться чистыми и сухими (в соответствии с потребностями данного вида);
• ооеспечивают одслошпую вентиляцию; обеспечивают животным доступ к пище и воде, а также позволяют легко заполнять, менять, обслуживать и чистить посуду, где содержится корм и вода;
• обеспечивают безопасность животного, т. е. исключают возможность его бегства, случайного попадания (целиком или конечностями) в щели или застревания между противоположными поверхностями;
• не имеют острых краев или выступов, которые могут травмировать животное;
• дают возможность наблюдать за животными, практически не вызывая их беспокойства.

Первичные ограждения должны изготавливаться из материалов, которые одинаково удовлетворяют как потребности животных, так и требования гигиены и санитарии. Они должны иметь гладкие, непроницаемые поверхности с минимальным количеством выступов, изгибов, углов и соприкасающихся поверхностей, что позволяет уменьшить накопление грязи, мусора и влаги и обеспечить возможность их очистки и дезинфекции. Они должны быть изготовлены из прочных материалов, не поддающихся коррозии и выдерживающих грубые воздействия, не трескаясь, не ломаясь и не ржавея. Менее прочный материал, например дерево, может оказаться более подходящим в некоторых ситуациях и может применяться при строительстве насестов, сооружений для лазания, отдыха, а также заборов. Первичные ограждения нуждаются в периодической замене в силу разрушения или при затруднении их санитарной обработки.
Все первичные ограждения должны поддерживаться в хорошем состоянии, чтобы предотвращать бегство или травмирование животных, способствовать их физическому комфорту и облегчать их
санитарную обработку и обслуживание. Ржавеющее или окисленное оборудование, которое угрожает здоровью или безопасности животных, должно ремонтироваться или заменяться новым.
Некоторые системы содержания животных имеют специальные клетки и вентиляционное оборудование, в том числе клетки с встроенными фильтрами, вентилируемые клетки, изоляторы и небольшие боксы. В целом назначение таких систем состоит в сведении до минимума распространения возбудителей инфекционных заболеваний воздушным путем между клетками или группами клеток.
Грызунов часто размещают на полу из проволочной сетки, которая облегчает соблюдение санитарных норм, позволяя собирать мочу и фекалии в расположенные под ней поддоны. Однако по некоторым данным, для грызунов предпочтительнее оказываются клетки с твердым дном и подстилом. Для содержания других видов животных, например собак и приматов, часто используются полы с виниловым покрытием.

Температура и относительная влажность окружающей среды могут зависеть от конструкции помещения и условий размещения животных. К факторам, которые могут способствовать колебаниям температуры и влажности, относятся конструкция и материалы, из которых изготовлены ограждения, использование фильтра с надставкой, количество животных в клетке, приточная вентиляция ограждения, частота смены подстилочного материала и его состав.
В некоторых ситуациях, например при послеоперационном восстановлении животного, содержании цыплят в течение первых дней после вывода, содержании некоторых грызунов, лишенных волосяного покрова, и новорожденных особей отдельно от матери, может потребоваться поддержание более высокой температуры. Диапазон повышения температуры зависит от условий содержания (Берг- хоф П. К., 1998).
При содержании животных в замкнутом пространстве диапазон суточных колебаний температуры должен быть сведен до минимума с тем, чтобы избежать многократных воздействий на метаболизм и поведение животных, изменяющихся для компенсации сдвигов температуры окружающей среды. Уровень относительной влажности также должен контролироваться, но в более широком диапазоне, чем температура (приемлемый диапазон

Шум, источником которого являются животные и обслуживающий их персонал, служит непременной характеристикой действующего вивария. Поэтому при проектировании и эксплуатации вивария необходимо учитывать возможность регулирования уровня шума.
Животных, создающих много шума, например собак, свиней, коз и приматов, следует помещать на расстоянии от тихих животных, например грызунов, кроликов и кошек. Воздействие шума с уровнем интенсивности, превышающим 85 дБ, может оказать влияние как на слуховой аппарат, так и на другие органы. Многие виды животных обладают способностью слышать звуки такой частоты, которые не доступны человеку, поэтому нужно обращать особое внимание на потенциальное воздействие аппаратуры, например видеоаппаратуры, и материалов, продуцирующих шум в диапазоне слышимости находящихся поблизости животных. В виварии нельзя пользоваться радиоаппаратурой, будильниками и другими приборами, создающими шум, если только они не входят в состав утвержденной экспериментальной аппаратуры или оборудования, предназначенного для обогащения среды обитания животных.
В зависимости от вида животных и направления их использования структура среды обитания должна включать планки для отдыха, полки или насесты, игрушки, кормушки и поилки, материал для строительства гнезд и нор, туннели, качели и другие предметы, которые предоставляют животным большие возможности для проявления видоспецифичного поведения, принятия нормальных поз и способствуют их благополучию.
Размещение и транспортировка животных. При размещении животных необходимо стремиться к тому, чтобы создать максимально благоприятные условия для видоспецифичного поведения и свести до минимума стрессовое воздействие. Для социальных видов животных такое требование обычно предполагает их размещение совместимыми парами или группами. Персонал, осуществляющий уход за животными, должен выработать стратегию наиболее целесообразного размещения животных, обеспечивающего их здоровье и благополучие, а также соответствующего задачам эксперимента.
Мышей, морских свинок, кроликов, крыс, хомяков, кур размещают в находящихся на стеллажах клетках, строго соблюдая плотность посадки, собак и обезьян - в отдельных кабинах, кошек - в вольерах. Дно клеток покрывают тонким слоем опилок или стружек, предварительно простерилизованных при 150-180°С в течение 15-20 минут. В поилках клеток должна быть питьевая вода, отвечающая требованиям СанПиН. Необходимо соблюдать нормы и режим кормления. Посуду для воды и кормов следует регулярно дезинфицировать, мыть и ополаскивать.
Потребности животных в занимаемом пространстве определяются разными факторами; при этом учет только массы или площади поверхности тела животного является недостаточным.
Для некоторых видов животных более благоприятным является наличие перегородок (например, грызуны, для которых характерен тигмотаксис), укрытий или сложной структуры клеток (например, кошки и шимпанзе), а не простое увеличение площади (Рахманов А. И., 2002).
Такие показатели состояния животных, как здоровье, размножение, рост, поведение, активность и использование ими пространства могут служить оценкой соответствия их размещения. Как минимум, животное должно иметь достаточно места, чтобы поворачиваться и принимать нормальные позы, иметь свободный доступ к кормушкам и поилкам, а также достаточное и свободное (покрытое чистой подстилкой) пространство, где

оно может удобно расположиться и отдыхать. В клетке для кошек необходимо установить приподнятую над полом платформу для отдыха. Такие платформы или выступы часто желательно устраивать для собак и приматов. Пространство, занимаемое кормушками, поилками, устройствами для туалета или другими приспособлениями, которые не предназначены для передвижения или отдыха, не должно входить в площадь пола.
Высота ограждений может иметь большое значение для нормального поведения и приспособления некоторых видов животных. При расчете высоты клеток нужно принимать во внимание типичные позы животного и достаточное место для обязательных элементов клетки, например кормушек, поилок, ванн с водой. Приматы некоторых видов используют вертикальные пространства клетки в большей степени, чем ее пол. Для их хорошего самочувствия важно предоставлять им возможность высоко взбираться на ветку и использовать вертикальное пространство, достаточное для размещения всего тела над полом клетки.
При расчете производственных площадей необходимо исходить из следующих нормативов размещения животных в клетках (табл. 55).
В табл. 56 приводятся рекомендуемые размеры клеток для других обычно используемых в лабораторных экспериментах животных. Эти данные основаны на потребностях животных при индивидуальном содержании. Размеры клеток могут быть пересмотрены при необходимости обогащения среды обитания или содержания животных с массой, превышающей указанную в таблице. При групповом содержании животных площадь общего пространства не является обязательно суммой величин, рекомендуемых для индивидуального содержания животных. При групповом содержании животных расчеты должны основываться на потребностях и поведенческих характеристиках животных данного вида, совместимости особей, количестве животных, а также задачах, которые ставятся при их размещении.
Высших обезьян массой более 50 кг лучше содержать в помещениях из кирпича, бетона и в проволочных ограждениях, а не в обычных клетках.
Все животные должны приобретаться законным путем. Если собаки и кошки поступают от дилеров или станций отлова животных, то таких животных следует осмотреть на предмет их возможной идентификации. Подобная проверка может выявить факт, что данное животное было домашним; в таком случае следует установить его владельца.
Использование специально выведенных экспериментальных животных возможно, если оно диктуется задачами исследования, обучения или испытаний.
Любые перемещения животных, в том числе внутри вивария, следует должным образом координировать с тем, чтобы свести до минимума время перевозки

Вид животных	№1асса, кг	Площадь пола на одно животное, м1	Высота от пола до потолка клетки, см
Кролики	ДоЗ	0,1	35,6
	ДО 4	0,3	35,6
	до 5	0,4	35,6
	более 5	0,5	35,6
Кошки	до 4	0,3	61,0
	более 5	0,4	61,0
Собаки	до 15	0,7	-
	до 30	1,1	-
	более 30	2,2	-
Обезьяны (включая павианов)
1 особь	до 1	0,1	50,8
2 особи	доЗ	0,3	76,2
3 особи	д О о	0,4	76,2
4 особи	до 15	0,5	81,3
5 особей	до 25	0,7	91,4
6 особей	до 30	0,9	116,8
7 особей	более 30	1,4	116,8
Человекообразные обезьяны
1 особь	до 20	0,9	139,7
2 особи	до 35	1,4	152,4
3 особи	более 35	2,3	213,4
Голуби	-	0,1	-
Перепела	-	0,02	-
Куры	д о 0,25	0,02	-
	до 0,5	0,05	-
	до 1,5	0,1	-
	до 3,0	0,2	-
	более 3,0	0,3	-

и риск передачи зоонозов, защитить животных от воздействия экстремальных условий окружающей среды, исключить слишком большую скученность животных, обеспечить при необходимости их доступ к корму и воде и предохранить от физических травм. Связанный с транспортировкой стресс является неизбежным, однако он может быть сведен до минимума при должном внимании к перечисленным выше факторам. Каждую партию животных необходимо проверять на соответствие требованиям получателя и на наличие клинических признаков заболеваний, при этом животных следует помещать в карантин и стабилизировать их состояние с помощью процедур, соответствующих данному виду и условиям.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ И ЗАДАНИЯ

1. Какие способы содержания собак и ухода за ними вы знаете?
2. В чем заключаются особенности содержания кошек и ухода за ними?
3. Какие гигиенические требования предъявляются при транспортировке собак и кошек?
4. В чем заключается гигиена выращивания молодняка собак и кошек?
5. Какие гигиенические требования к кормлению и поению собак и кошек?
6. Какие требования предъявляют к выбору места для вивария и его устройству?
7. В чем заключаются зоогигиенические требования к вивариям?
8. Как обеспечивается оптимальный микроклимат в виварии?
9. Какие санитарно-гигиенические требования предъявляют при содержании лабораторных животных?

Как проводится размещение и транспортировка лабораторных животных?

Тема 4. Использование лабораторных животных в диагностических исследованиях. Цели использования лабораторных животных в вирусологии

Задание к следующему занятию

Подведение итогов занятия

Задания

1. Найти под световым микроскопом в препаратах и зарисовать:

а) цитоплазматические тельца-включения;

б) внутриядерные тельца-включения;

в) вирионы вируса оспы в окраске по Морозову.

2. Ознакомиться с устройством и принципом работы электронного микроскопа.

3. Дешифрировать электронные микрофотографии вирионов разных вирусов (дать их схематический рисунок).

Самостоятельная работа студентов

Студенты знакомятся с устройством светового, люминесцентного и электронного микроскопов (в лаборатории), зарисовывают схему строения электронного микроскопа. Знакомятся с подготовкой препаратов для электронной микроскопии. Просматривают готовый препарат в люминесцентном микроскопе. Зарисовывают схему прямого и непрямого метода РИФ.

Контрольные вопросы:

1. Устройство электронного микроскопа.

2. Методы подготовки препаратов для просмотра в электронном микроскопе.

3. Люминесцентную микроскопию (РИФ) прямой и непрямой методы.

4. Значение электронной и люминесцентной микроскопии в вирусологических исследованиях.

Цель занятия: ознакомить студентов с требованиями к видам лабораторных животных, их карантинированием, содержанием, кормлением, мечением.

Оборудование и материалы: набор инструментов в стерилизаторе (ножницы, иглы, шприцы, пинцеты, корнцанги), лабораторные животные, ватные спиртовые тампоны краски для мечения, эфир, ксилол, мультимедийное оборудование, плакаты и презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Объяснение преподавателя: Большинство вирусов разных таксономических групп могут быть отличимы друг от друга на основе патогенности для лабораторных животных разных видов или возраста.

4.1 Виды лабораторных животных. Наиболее широко в вирусологических лабораториях применяют мышей, бе­лых крыс, кроликов, морских свинок, хомяков, цыплят. У молодых мышей экс­периментально воспроизводят грипп, альфа- и флавивирусные инфекции, ящур (на новорожденных мышатах) и др. Они восприимчивы ко многим вирусам, их легко разводить и с ними удобно работать. Лучше использовать мышей инбредных линий, так как они почти одинаково реагируют на тот или иной вирус. У крыс также создают инбредные линии, но эти животные более устойчивы к оп­ределенным вирусным инфекциям, чем мыши. Онкогенность некоторых виру­сов широко изучают на золотистых хомячках. Для вирусологических опытов обычно используют гладкошерстных морских свинок массой 250–300 г.

Ту или иную инфекцию иногда изучают на животных нескольких видов, об­ладающих разной чувствительностью к данному вирусу, что позволяет диффе­ренцировать вирусы, вызывающие клинически сходные симптомы болезни (на­пример, ящур, везикулярный стоматит, везикулярная экзантема и везикулярная болезнь свиней).

По генетическим качествам лабораторных животных делят на четыре группы:

1) животные смешанного происхождения, полученные от разных животноводов, такие животные гетерогенны;

2) животные, полученные непосредственно из од­ного источника, однако генетически такие животные вариабельны;

3) инбредные линии животных. Их получают в результате спаривания брата с сестрой или родителей с детьми по крайней мере не менее 20 поколений. При таком методе разведения достигается все возрастающая степень гомозиготности.

4) однородные гибриды F 1 . Высокая степень гетерозиготности, характерная для каждого гибрида, связана здесь с генетическим однообразием, которое соответствует степени гомозиготности родительских линий. Как правило, однородные гибриды F 1 менее изменчивы, чем обе родительские ли­нии. Животные-мутанты имеют отдельно выраженный наследственный фактор, который обусловливает видимое отклонение от нормальной формы.

Отрицательная сторона выделения вируса на лабораторных животных – воз­можность диагностических ошибок вследствие активации скрытого вирусоносительства. В этом случае развитие симптомов болезни после введения матери­ала не следствие действия введенного вируса, а результат самой процедуры, на­рушающей предшествующее равновесие в организме. В это время проявляется вирус или другой инфекционный агент, длительно персистирующий в организ­ме. Выражается это резкими неврологическими симптомами (повороты вдоль длинной оси тела).

Наличие скрытой вирусной инфекции может также выражаться уменьшени­ем или исчезновением чувствительности животных к исследуемому вирусу вслед­ствие явления интерференции. Возможен и противоположный эффект, а имен­но – явление синергизма в действии вирусов, что дает иногда результаты, труд­ные для правильной интерпретации.

Для некоторых вирусологических работ, например при выделении вируса с невыясненными болезнетворными свойствами, необходимо использовать гнотобиотов. Термин «гнотобиоты» объединяет две категории животных: безмик­робных (стерильных), не содержащих никаких жизнеспособных микробов, и гнотофор – носителей одного (моногнотофоры), двух (дигнотофоры) или более (полигнотофоры) микроорганизмов. В настоящее время безмикробные животные по динамике роста делятся на три группы: I – обезьяны, поросята, цыплята растут лучше обычных животных или наравне с ними; II – крысы, мыши, собаки, кошки растут наравне с обычными животными; III – морские свинки, кролики, козлята, ягнята растут хуже обычных животных.

Стерильных птиц получают посредством инкубации яиц со стерильной скор­лупой в стерильном инкубаторе, лабораторных животных – путем кесарева се­чения или гистерэктомии. Содержат животных в стерильных изоляторах. Воз­дух, вода и корм должны быть стерильными.

Особое значение среди гнотобиотов занимают СПФ-животные (Specific pathogen free), которые свободны только от патогенных микроорганизмов. В их организме имеются все необходимые для нормальной жизнедеятельности бактерии и ви­русы, которые в совокупности создают группу так называемой резидентной (по­лезной) микрофлоры. В настоящее время получены лабораторные СПФ-живот­ные – крысы, морские свинки, кролики, поросята, птицы и др.

4.2 Цели использования лабораторных животных. В настоящее время лабораторных животных используют в вирусологии для:

– обнаружения вируса в патматериале;

– первичного выделения вируса из патматериала;

– накопления вирусной массы;

– поддержания вируса в лаборатории в активном состоянии;

– титрования вируса;

– получения гипериммунных сывороток;

– в качестве тест-объекта в реакции нейтрализации.

В вирусологии используют кроликов, морских свинок, белых крыс, белых мышей, золотистых хомячков. Однако только некоторые вирусы удается культивировать на животных перечисленных видов. Во многих случаях для тех же целей используют других чувствительных к данному вирусу животных: кур, голубей, котят, щенков и т. д. Так, биопробу при диагностике оспы птиц ставят на курах, оспы овец – на овцах, чумы свиней – на подсвинках.

4.3 Требования к лабораторным животным. Комплектуя группы животных для вирусологических исследований, необходимо выполнять следующие требования:

– животное должно быть чувствительным к данному вирусу;

– возраст его имеет большое значение для культивирования многих вирусов. Большинство вирусов лучше размножается в организме молодых и даже новорожденных животных. Например, для биопробы на бешенство и ящур используют мышей-сосунов, на ларинготрахеит птиц – цыплят. Но в то же время заражение взрослых кроликов вирусом болезни Ауески ведет к появлению ярких и специфичных клинических признаков заболевания;

– стандартная чувствительность достигается подбором животных определенного возраста и одинаковых по массе;

– лабораторные животные должны быть здоровы. Животные, поступающие в виварий вирусологической лаборатории, должны быть привезены из благополучного по инфекционным заболеваниям хозяйства. Их содержат изолированно, т. е. в карантине (белых мышей и крыс 14 дней, а остальных животных 21 день). В этот период за животными ведут ежедневное клиническое наблюдение. При подозрении на наличие инфекционной болезни животных подвергают лабораторному исследованию. В случае установления инфекционного заболевания среди животных всю поступившую партию уничтожают.

4.4 Содержание лабораторных животных. Виварий для лабораторных животных должен иметь основное помещение для животных, моечную (с боксом, сушиль­ными и стерилизационными установками), кухню для приготовления корма с одним по крайней мере столом, оборудованным для приготовления корма, и холодильником для скоропортящихся продуктов, кладовую, операционную, гар­дероб и санитарное помещение для обслуживающего персонала. Помещения должны быть чистыми. Стены и полы легко дезинфицируемыми. Запасы корма следует хранить в специальных помещениях. В местах содержания опытных животных желательно иметь гигрометр и термометр.

Мышей, крыс, хомяков и морских свинок в период опыта рекомендуется содержать в стеклянных банках с крышкой из проволочной сетки или перфори­рованного листового железа. Это облегчает наблюдение за ними, а банки легко чистить и дезинфицировать. Можно содержать животных в металлических клет­ках, которые также легко дезинфицировать.

В качестве подстилки применяют материалы, которые адсорбируют влагу и могут быть использованы животными для постройки гнезда: стружку для мы­шей, крыс, хомяков, морских свинок, хорьков, кур; опилки для крупных мы­шей, крыс, хомяков, хорьков, кур; солому для хомяков, морских свинок, кроли­ков, собак, кур; мякину для мышей, крыс; сено для мышей, крыс, хомяков, хорьков, кур; песок для кур. Следует использовать такую подстилку, которая образует как можно меньше пыли, так как последняя может привести к заболева­нию органов дыхания. Любую подстилку необходимо предварительно стерили­зовать при 100 °С в течение 30 мин.

Помещения для лабораторных животных периодически дезинфицируют, осо­бенно перед размещением новой партии животных. Это относится и к предме­там ухода за животными (лопаты, скребки, метелки и др.), которые соприкаса­ются с навозом и различными отбросами из помещения. После окончания каж­дого опыта клетки обязательно обрабатывают дезинфицирующими растворами, чему должна предшествовать чистка как клеток, так и помещения.

Посуду для корма и воды ежедневно смачивают дезинфицирующим раствором, после чего моют и споласкивают чистой водой. Помещения обрабатывают 1% раствором едкого натра, который используют в течение суток. Дезковрики пропитывают свежим раствором каждые 2 дня. Для дезинфекции предме­тов ухода, мытья полов и посуды рекомендуется использовать 3% раствор хлорамина, который должен быть применен в течение 2 ч. В виварии необходи­мо уничтожать вредителей: мух, комаров, блох, власоедов, клещей, вшей, му­равьев, мышей, крыс.

Лабораторных животных размещают так, чтобы, с одной стороны, было обеспечено функционирование всех систем организма в пределах физиологической нормы, с другой – исключено взаимное перезаражение и распространение инфекции за пределы вивария. Животных содержат в виварии с учетом их физиологической потребности в освещенности и температуре. Так, мышам, крысам нужны полумрак и температура воздуха около 20 °С, морским свинкам, кроликам и курам – дневной свет и температура в пределах 16–23, 14–18 и не ниже 0°С соответственно. Плотность посадки должна составлять примерно 1 г массы лабораторных животных на 1 см 2 дна клетки. Животных обеспечивают регулярным и полноценным кормлением и постоянно питьевой водой.

Если виварий один, зараженных животных содержат изолированно от здоровых и с последних начинают уборку помещения и кормление. Для ухода за зараженными животными используют отдельный инвентарь и кормушки. Лучше иметь два вивария: для содержания здоровых и зараженных животных.

Обслуживающий персонал при работе в виварии пользуется спецодеждой: халатом, резиновыми перчатками, фартуком, непромокаемой обувью. В виварии ежедневно дезинфицируют инвентарь и проводят влажную уборку с применением дезинфицирующих веществ. По окончании эксперимента клетки дезинфицируют, погибших животных обезвреживают сжиганием в печах или автоклавированием.

В группу для проведения опыта подбирают животных с одинаковыми показа­телями массы, температуры, состава крови и т. д. От этого в значительной степени зависит успех выделения, титрования и пассирования вируса. При этом учитывают восприимчивость животных к различным вирусам. Отобранных животных метят, распределяют по банкам или клеткам, отмечают дату постановки опыта, его номер, заражающую или профилактическую дозу препарата и, если необходимо, как мечены животные. Последнее важно, когда в одной банке или клетке находятся животные нескольких групп.

Таблица 1

Масса животных в разном возрасте

РД-АПК 3.10.07.02-09

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Москва 2009

Разработаны: канд. с.-х. наук, ст. науч. сотр. П.Н. Виноградовым, канд. техн. наук С.С. Шевченко, О.Л. Седовым, Е.С. Гарафутдиновой, М.Ф. Малыгиным (НПЦ «Гипронисельхоз»); д-р вет. наук, проф. В.Г. Тюриным (ГНУ ВНИИВСГЭ)

ВНЕСЕНЫ: НПЦ «Гипронисельхоз».

УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ: заместителем Министра сельского хозяйства Российской Федерации А.И. Беляевым 1 декабря 2009 г.

РАЗРАБОТАНЫ ВПЕРВЫЕ.

Дата введения 15.12.2009

1 Общие положения

1.1. Настоящие методические рекомендации распространяются на все научно-исследовательские организации и учебные заведения АПК России независимо от их организационно-правовой формы, использующие в своей работе лабораторных (экспериментальных, подопытных) животных.

В соответствии с Федеральным законом «О техническом регулировании » (принят Государственной Думой 15 декабря 2002 г. и одобрен Советом Федерации 18 декабря 2002 г.) до принятия соответствующих регламентов техническое регулирование в области принятия ветеринарно-санитарных мер осуществляется в соответствии с Законом Российской Федерации «О ветеринарии» (утвержден 14 мая 1993 г., № 4979-1).

1.2. Методические рекомендации распространяются как на вновь проектируемые объекты для содержания и работы с лабораторными животными - экспериментально-биологические клиники, виварии и др., так и на действующие и реконструируемые.

1.3. Объекты для содержания и работы с лабораторными животными являются научно-вспомогательными подразделениями научно-исследовательских организаций, учебных заведений и создаются для содержания и при необходимости для разведения лабораторных животных, используемых в экспериментальных работах и исследованиях. На этих объектах может проводиться также и самостоятельная разработка отдельных научных вопросов.

1.4. Изложенные в данных методических рекомендациях нормативы и требования по проектированию, строительству и эксплуатации объектов для содержания лабораторных животных направлены на обеспечение безопасности работающего с животными персонала и населения в целом от возникновения антропозаонозов и других заболеваний.

1.5. Разработка, согласование, утверждение и состав проектной документации на строительство объектов для содержания лабораторных животных осуществляются в соответствии с требованиями СНиП 11.01-2003 .

1.6. Объект для содержания лабораторных животных (далее виварий) размещается в отдельно стоящем здании (комплексе зданий) или на верхних этажах лабораторных корпусов ветеринарных государственных научных учреждений, а также на территории учебных заведений.

1.7. Виварии должны быть обеспечены водой питьевого качества, в том числе горячей, электроэнергией, оборудованы канализацией (трубы диаметром не менее 100 мм), приточной и вытяжной вентиляцией, отоплением, охранной и пожарной сигнализацией, иметь удобные подъездные пути.

1.8. Расстояние между отдельно стоящим зданием вивария и сооружениями научно-исследовательских учреждений, в состав которых входит настоящий виварий, должно быть не менее расстояния противопожарных разрывов, установленных действующими правилами пожарной безопасности в Российской Федерации.

1.9. Отдельно стоящие здания вивариев должны быть огорожены глухим забором и отделены от жилого массива санитарно-защитной зоной. Территория должна быть озеленена.

Размеры санитарно-защитной зоны определяются требованиями СаНПиН 2.2.1/2.1.1.1200-03 .

1.10. Размеры санитарно-защитной зоны для вивариев, расположенных в отдельно стоящих административных, производственных зданиях и имеющих изолированный выход, согласовываются в каждом конкретном случае с органами государственного санитарного и ветеринарного надзора.

2. Состав, взаиморасположение и нормы площади помещений вивариев

2.1. В состав каждого вивария должны быть включены помещения, запроектированные в соответствии с действующими строительными нормами и правилами с соблюдением действующих ветеринарно-санитарных требований и зоогигиенических нормативов, в том числе:

комната обслуживающего персонала с индивидуальными шкафчиками для спецодежды;

помещения для приема и карантинирования вновь поступающих в виварий животных;

изолятор;

помещения для содержания подопытных животных (отдельные для каждого вида) или (по согласованию с органами государственного ветеринарного и санитарного надзора) разделенные на секции по видам животных;

стерилизационная или бокс для работы исследователей с незараженными животными, с помещением для вскрытия животных и холодильником для временного хранения трупов;

изолированные помещения для содержания подопытных животных, зараженных культурами возбудителей особо опасных инфекций или радиоактивными веществами (раздельно) с операционной при каждом изолированном помещении, имеющей холодильник и необходимое оборудование для заражения и вскрытия животных;

кормокухня для приготовления кормов (должна быть оборудована плитой и холодильником);

дезинфекционно-моечное отделение для мойки горячей водой, дезинфекции и сушки клеток и другого инвентаря;

склад чистого (обеззараженного) запасного инвентаря: клеток, поилок и др.;

санитарный блок (душевая и туалет);

помещение, оборудованное печью для сжигания трупов животных;

общая холодильная камера для хранения трупов животных;

склад кормов;

склад подстилки;

в отдельном помещении или в отдельно расположенном здании - технический узел для кондиционеров, вентиляционных, электротехнических и других специальных установок.

2.2. В каждом виварии должно быть помещение для приема поступающих животных. В вивариях, в которых содержат мелких грызунов, перед приемным отделением устанавливается утепленный тамбур, в который въезжает и разгружается машина с прибывшими животными.

При размещении вивария на верхних этажах лабораторных корпусов приемное отделение и утепленный тамбур располагаются на первом этаже лабораторного корпуса и связываются с виварием лифтом, используемым только для подъема лабораторных животных.

2.3. Помещение приема представляет собой комнату площадью 12,5 - 18 м 2 с естественным и искусственным освещением в соответствии с требованиями .

Высота всех помещений вивария составляет 3 - 3,5 м.

2.4. Помещение карантина состоит из нескольких изолированных комнат площадью 12,5 - 18 м 2 и изолируется от помещений, в которых содержатся животные, прошедшие карантин и поступающие для проведения экспериментов.

2.5. К помещениям карантина примыкает помещение изолятора для больных животных и животных с подозрением на заболевания. Площади комнат изолятора аналогичны площадям комнат для карантина.

2.6. Помещения, предназначенные для содержания подопытных животных, могут выходить в один общий коридор или располагаться между двумя коридорами и иметь выходы в каждый из них. При однокоридорной планировке «грязные» и «чистые» службы располагают в разных концах коридора.

При двухкоридорной системе по одному коридору («чистому») поступают корма, прошедшие карантин животные, входят перед началом работы с животными сотрудники в чистой спецодежде и сменной обуви. По другому («грязному») коридору удаляют несъеденные корма и навоз, выносят трупы животных, выходят сотрудники после работы с животными.

При невозможности изоляции «грязных» и «чистых» потоков допускается использование одного и того же помещения для той или другой цели при условии, что оно будет дезинфицироваться каждый раз после прохождения по нему «грязного» потока.

2.7. Площадь помещений для содержания отдельных видов подопытных животных составляет 12,5 - 18 м 2 ; площадь помещения для содержания подопытных животных, разделенная на секции, определяется расчетом.

2.8. Площадь стерилизационной или бокса для работы исследователей с незараженными животными определяется расчетом, исходя из специфики предполагаемой работы.

2.9. Площади изолированных помещений для работы с подопытными животными, зараженными возбудителями особо опасных инфекций, и для работы с подопытными животными, зараженными радиоактивными веществами, а также площади операционных при каждом изолированном помещении определяются расчетом, исходя из условий применяемого технологического и специального оборудования для проведения необходимых манипуляций.

2.10. Общая площадь помещений, занимаемая кормокухней, дезинфекционно-моечным отделением и складом чистого запасного инвентаря, должна составлять примерно 50 % от общей площади помещений, занятых животными (в крупных вивариях этот процент может быть несколько уменьшен).

Кормокухня состоит из двух смежных помещений, предназначенных для переработки и приготовления кормов. Каждое помещение должно иметь выход в коридор.

Дезинфекционно-моечное отделение (одно или несколько) состоит из двух комнат, соединенных проходным автоклавом или проходной сухожаровой камерой.

Устройство дезинфекционно-моечного отделения должно предусматривать различную последовательность его работы:

при наличии инфицированного материала - предварительную стерилизацию инвентаря и подстилки с дальнейшей механической очисткой последнего в другом помещении;

стерилизацию после механической очистки клеток и инвентаря, когда нет опасности наличия зараженного материала.

Независимо от размещения вивария (в отдельно стоящем здании или на верхнем этаже лабораторного корпуса) в дезинфекционно-моечном отделении следует предусматривать мусоропровод для удаления грязной подстилки и механизированный подъем материалов и оборудования.

Склад чистого инвентаря и оборудования размещается рядом с дезинфекционно-моечным отделением.

2.11. Для хранения подстилки (стружки, опилки, торф и др.) выделяются два помещения: одно для простерилизованной и упакованной в используемую данным виварием тару, другое - для хранения вновь приобретенной подстилки.

2.12. При проектировании помещений вивария необходимо обеспечить максимальную изоляцию:

всех его помещений от остальных подразделений, входящих в состав научно-исследовательского учреждения;

помещений изолятора и карантина от остальных помещений вивария;

между кормокухней, помещениями для животных и дезинфекционно-моечным отделением.

2.13. В каждом конкретном случае площадь, занимаемая кормокухней, дезинфекционно-моечным отделением и складом чистого запасного инвентаря, устанавливается в зависимости от применяемого оборудования, степени механизации производственных процессов и видов корма для подопытных животных.

Размеры площадей вышеперечисленных помещений указываются в задании на проектирование.

3. Ветеринарно-санитарные и технологические требования к строительным решениям помещений вивария и инженерному оборудованию

Светильники и осветительная арматура закрытого типа должны быть доступны для влажной очистки.

3.5. Помещения вивария, в которых содержатся лабораторные животные, оборудуются принудительной приточно-вытяжной системой вентиляции, обеспечивающей кратность воздухообмена и температурно-влажностный режим в соответствии с данными, приведенными в табл. .

Вид животных	Температура, °С		Относительная влажность, %		Максимально допустимая концентрация в воздухе
	колебания	средняя	колебания	средняя	аммиака, мг/л	углекислоты по объему, %	вытяжка	приток
Мыши	18 - 22		50 - 65		0,01	0,15
Крысы	18 - 22		50 - 65		0,01	0,15
Хомяки	18 - 22		50 - 65		0,01	0,15
Морские свинки	15 - 18		50 - 65		0,01	0,15
Кролики	15 - 18		50 - 65		0,01	0,15
Собаки	18 - 22		50 - 65		0,01	0,15
Кошки	18 - 22		50 - 65		0,01	0,15

3.6. Температурно-влажностный режим в других помещениях вивария должен обеспечиваться в соответствии с данными, приведенными в табл. .

Помещение	Температура в холодный и переходный период года, °С	Кратность воздухообмена (объемов в час)
		приток	вытяжка
1. Для персонала
2. Для приема животных
3. Для исследований
4. Моечное-стерилизационное		1 - 2	2 - 3
5. Для усыпления (эвтаназии)
6. Вскрывочное
7. Утилизационное		По расчету
8. Для содержания подопытных сельскохозяйственных животных	3.11. Для отвода и сбора сточных вод после мойки и дезинфекции технологического оборудования и полов следует предусматривать устройство лотков, перекрытых съемными дырчатыми плитами и трапами. Уклон лотков должен быть не менее 0,02. 3.12. При проектировании системы локальной канализации вивариев следует соблюдать следующие требования: сточные воды из помещений для сжигания трупов подлежат стерилизации в манжусах острым паром при температуре 120 °С в течение 30 мин или в пароструйной установке при температуре 110 °С в течение 10 мин; при наличии особо опасных инфекций сточные воды стерилизуют при 140° и 130 °С в течение 20 и 60 мин соответственно; производственно-бытовые стоки от мытья полов и мытья и дезинфекции технологического оборудования должны собираться в специальный приемник, а перед спуском в канализацию дезинфицироваться хлорсодержащими препаратами; ливневые стоки с территории отдельно стоящих вивариев, неблагополучных в ветеринарно-санитарном отношении, подлежат дезинфекции химическими препаратами; образующиеся механические и биологические осадки сточных вод подвергаются сжиганию. 3.13. Магистральные короба приточно-вытяжной вентиляции, электропитание, трубы водопровода и канализации должны располагаться в специальных нишах коридоров и иметь свободный доступ для проведения осмотра и ремонта. 3.14. Изолированные помещения для содержания подопытных животных, зараженных культурами возбудителей особо опасных инфекций или радиоактивными веществами, и помещение изолятора оборудуются локальными системами вентиляции с фильтрами, обеспечивающими 100 %-ную очистку и дезинфекцию выбрасываемого воздуха. Система вентиляции должна обеспечивать в этих помещениях пониженное (на 3 - 5 мм рт. ст.) давление атмосферного воздуха по отношению к другим помещениям вивария. Вентиляция в этих помещениях за счет открывания окон запрещена. 4. Оборудование вивария и условия размещения животных 4.1. Мыши, крысы, хомяки, морские свинки и кролики размещаются в клетках, устанавливаемых на металлических стеллажах. 4.2. Настенные или другой конструкции стеллажи должны быть со съемными кронштейнами и подвижными полками, что позволяет переоборудовать их под клетки различных габаритных размеров с разными видами лабораторных животных. 4.3. Для расчета производственных площадей необходимо исходить из следующих нормативов размещения животных в клетках (табл. ). Вид животных Минимальная площадь дна клетки на одно животное, см 2 Число животных максимально допустимое в клетке на 1 м 2 площади пола помещения Мыши 65 взрослых или240 молодняка Крысы 20 взрослых или100 молодняка Хомяки 30 - 40 Морские свинки 15 - 18 Кролики 2000 3 - 4 Примечания. 1. Для примерного определения производственной площади следует исходить из расчета, что на 1 см 2 площади дна клетки должен приходиться 1 г массы животного. 2. Стеллажи размещаются в основном вдоль стен и должны занимать примерно 40 % производственной площади. 4.4. Собаки размещаются в отдельных кабинах (боксах) строго индивидуально. Размеры бокса должны соответствовать длине и росту животных. Размеры бокса для крупных собак живой массой свыше 22,5 кг - 1,2×1,8 м = 2,2 м 2 , средних массой 16 - 22,5 кг - 1,2×1,5 м = 1,8 м 2 , небольших массой 4,5 - 16 кг - 0,9×1,2 м = 1,1 м 2 . Зазор между прутьями 4,5 - 5,5 см, диаметр металлических прутьев 0,5 - 0,6 см. Боковые стенки - сплошные. На нижнюю стенку (пол) укладывают деревянные щиты. Кормление и поение - в боксе. Вольеры для выгула устраивают индивидуальные, из расчета до 2 м 2 на одно животное. Время выгула - не менее 2 раз в сутки, продолжительность - не менее 20 мин. Следует предусматривать раздельное секционное содержание самцов от самок, щенков и агрессивных животных. 4.5. На территории вивария для собак возводят специальные помещения, оборудованные кабинами. К кабинам пристраивают вольеры (выгулы). У каждой собаки должен быть свой вольер. Размеры кабины, м: длина - 2; ширина - 1,5; высота передней стенки - 2,5 и задней - 1,5 - 2; высота дверей кабины - 1,7, ширина - 0,7. Над дверью кабины устанавливают застекленную раму. Внизу двери, установленной в задней стенке кабины, являющейся передней стенкой вольера, делают лаз в вольер размерами 40×50 см, который на зиму завешивают плотной тканью для защиты от холода. Размеры вольера, м: длина - 3, ширина - 2, высота - 2,2. В его передней стенке делают дверь размерами 1,8×0,7 м. 4.6. Кошки размещаются в вольерах по пять голов, где предусматривается устройство полок (лежаков), достаточных по площади для размещения всех животных. Площадь вольера на одну кошку 0,5 м 2 . Перед входом в вольер оборудуется сетчатый тамбур. 4.7. В случае размещения в вивариях для научных целей сельскохозяйственных животных и птицы помещения для них сооружаются в соответствии с действующими нормами технологического проектирования с соблюдением зоогигиенических нормативов, изложенных в этих нормах. 5. Прием животных в виварий 5.1. Пополнение вивария животными и птицей производится из специализированных питомников, благополучных по инфекционным заболеваниям. Приобретение животных и птиц в других организациях и у частных лиц допускается при отсутствии возможности закупки их в питомниках и наличия при каждой покупке ветеринарного свидетельства о благополучии организации (хозяйства, частного лица) по инфекционным заболеваниям. 5.2. Прием животных в виварий производится при наличии ветеринарного свидетельства или сопроводительных документов из питомника. 5.3. Полученные из питомника животные размещаются в изолированных секциях сроком на три дня для адаптации к новым условиям. Последующие сроки изоляции или карантина для этих животных определяются в зависимости от условий содержания животных, характера предстоящих экспериментов, расстояния, условий перевозки и др. 5.4. Для животных, полученных не из питомников, устанавливаются следующие сроки их карантина: для мышей и крыс - 14 дней, морских свинок и кроликов - 21, собак и кошек - 30, для остальных животных и птиц - 21 день. В отдельных случаях при использовании в экспериментах беременных самок, новорожденных и молодых животных, а также в краткосрочных опытах продолжительность карантина может быть сокращена при условии размещения этих животных в изолированных помещениях и соответствующего наблюдения. 5.5. В период карантина за животными ведется ежедневное клиническое наблюдение: термометрия и регистрация общего состояния животных в специальном журнале. 5.6. В карантинных и экспериментальных секциях животные помещаются в чистые, заранее продезинфицированные (проавтоклавированные) клетки. 5.7. Уход за животными, находящимися в здании карантина, осуществляется персоналом, закрепленным за данными помещениями. 5.8. Запрещается выносить из карантинных помещений в другие помещения и секции для экспериментальных животных корма, спецодежду и инвентарь. 5.9. В течение периода карантина производится периодическая смена клеток. По окончании карантина освободившиеся клетки и инвентарь передаются в дезинфекционно-моечное отделение. Чистка и мойка клеток и другого инвентаря из карантинных секций могут производиться в общем дезинфекционно-моечном отделении вивария только после предварительного обеззараживания. Отходы также должны обеззараживаться или сжигаться. Методы дезинфекции, дезинсекции и режим автоклавирования устанавливаются в каждом конкретном случае в зависимости от специфики работы учреждения. 5.10. В период адаптации или карантина животные с подозрением на инфекционные заболевания подвергаются бактериологическому исследованию. При подтверждении инфекционного заболевания мыши, крысы, хомяки, морские свинки и кролики всей поступившей партии уничтожаются, а в отношении собак, кошек и других животных сроки карантина продлеваются в зависимости от установленного заболевания. 5.11. Помещения карантина после каждой партии переданных на эксперимент животных и после каждого случая выявления инфекционных заболеваний подвергаются тщательной дезинфекции. 5.12. В случае возникновения массовых заболеваний среди животных, наблюдавшихся на карантине, или при обнаружении в период экспериментов отдельных случаев инфекционных заболеваний, особо опасных для лабораторных животных и человека, в виварии проводится необходимый комплекс профилактических мероприятий. В этом случае проведение опытов на животных временно прекращается. 5.13. По истечении срока карантина животные переводятся в экспериментальные секции. 6. Режим работы и основные правила содержания животных 6.1. В каждом отдельном помещении рекомендуется содержать животных только одного вида. Если по условиям эксперимента необходимо совместное содержание лабораторных животных разных видов в одной секции, то их следует размещать на разных стеллажах. 6.2. На каждой клетке (боксе, вольере и т.д.) должна быть этикетка с указанием данных о животном и сроках эксперимента. 6.3. Лабораторные животные и птицы содержатся в клетках со сплошным дном на подстилке или в клетках с сетчатым дном - полом. В качестве подстилки применяются древесные опилки, стружка или подстилочный торф. Подстилка заранее автоклавируется или выдерживается в сухожаровом шкафу (при 150 - 180 °С 15 - 20 мин). Толщина слоя подстилки в клетке 5 - 10 мм. При содержании животных в клетках с сетчатым дном подстилка насыпается в поддон (противень), находящийся под сетчатым полом. 6.4. Вся работа по уходу и содержанию лабораторных животных строится в соответствии с распорядком дня и регламентом работ, утвержденными руководителем данного учреждения. В распорядке дня предусматривается время на санитарную обработку помещения и оборудования, раздачу кормов и проведение экспериментальных работ и манипуляций. 6.5. Кормление лабораторных животных осуществляется в соответствии с существующими нормами. 6.6. Корма и полуфабрикаты хранятся в специально отведенном для этой цели помещении. Выдача кормов производится в установленном порядке. В кормокухне вивария допускается хранение не более чем двух-трехдневного запаса кормов. При кормлении животных гранулированными кормами и при наличии в клетках бункеров-кормушек разрешается авансовое получение кормов со склада на семь-десять дней. 6.7. Для хранения запаса кормов на кормокухне и в кладовой вивария оборудуются специальные лари (металлические или обитые изнутри жестью). Скоропортящиеся продукты хранятся в холодильнике. Доставка кормов со склада производится специально выделенным персоналом (рабочими, не занятыми непосредственно уходом за животными). 6.8. Распределение кормов по комнатам-секциям производится специально выделенным для этих целей рабочим или персоналом кухни в продезинфицированной посуде (таре), закрепленной за каждой секцией. Списание кормов осуществляется в установленном порядке согласно фактическому наличию животных на каждый день. 6.9. Вход в кормокухню персонала, осуществляющего уход за лабораторными животными, и посторонних лиц запрещается. 6.10. Снабжение лабораторных животных питьевой водой производится из водопровода, качество воды должно соответствовать СаНПиН 2.1.4.1074-01 . 6.11. Проращивание зерна на зеленую массу для подкормки лабораторных животных производится в специально отведенных для этих целей помещениях. Допускается скармливание животным корневой массы растений при отсутствии в ней плесени. 6.12. Раздача кормов и поение животных должны осуществляться только после окончания уборки помещения, чистки или смены клеток и выноса из секций грязного оборудования, поддонов с подстилкой и других материалов, подлежащих дезинфекции или утилизации. 6.13. Чистка клеток и уборка комнат производится с помощью инвентаря, строго закрепленного за каждой комнатой. 6.14. При периодической смене клеток животные 1 - 2 раза в неделю пересаживаются в заранее продезинфицированные клетки с подготовленной подстилкой, кормушками и поилками. Грязные клетки вместе с подстилкой, кормушками и поилками передаются в дезинфекционно-моечное отделение для их последующей обработки. 6.15. Чистка клеток осуществляется ежедневно. При этом загрязненная подстилка и прочие отходы из клеток собираются в специальные металлические бачки с крышками. Бачки плотно закрываются и передаются в дезинфекционно-моечное отделение. 6.16. При использовании клеток с сетчатым дном и изолированными от клеток поддонами последние периодически (не реже одного раза в неделю) заменяются новыми. Грязные поддоны с подстилкой передаются в дезинфекционно-моечное отделение для их последующей обработки. 6.17. При обслуживании одним рабочим нескольких видов лабораторных животных сначала обрабатываются клетки с морскими свинками, затем клетки с мышами, крысами и кроликами, в последнюю очередь - помещения, где содержатся собаки и кошки. 6.18. Мыть и дезинфицировать клетки, кормушки и поилки непосредственно в секциях запрещается. 6.19. Перед окончанием рабочего дня в секциях, производится влажная уборка пола с использованием 1 %-ного раствора хлорамина или другого дезинфицирующего вещества. Не реже одного раза в месяц проводится санитарный день, в течение которого осуществляется уборка всех помещений. Порядок проведения санитарного дня определяется заведующим виварием. 6.20. Дезинфекция, чистка и мойка клеток, кормушек, поилок и другого инвентаря производится рабочими, специально закрепленными за дезинфекционно-моечным отделением. Контроль за эффективностью чистки и обеззараживания инвентаря возлагается на ветеринарного врача вивария. 6.21. Условия сбора, хранения, вывоза (или утилизации) отходов (подстилка, навоз, остатки корма и т.д.) должны быть определены в каждом конкретном случае по согласованию с местными органами и учреждениями Роспотребнадзора. При работе с инфицированным материалом необходимо проводить обезвреживание отходов с помощью автоклавирования или обработки дезинфицирующими растворами. 6.22. В секциях с подопытными животными следует вести постоянный контроль за температурно-влажностным режимом. Для контроля качества воздушной среды в помещениях, где содержатся животные, рекомендуется периодически (2 - 3 раза в месяц) определять концентрацию вредных газов (диоксида и аммиака). 6.23. Передача животных на опыты производится по разовым требованиям согласно годовой заявке от лабораторий, утвержденной руководителем учреждения. Работа с животными разрешается только в часы, предусмотренные распорядком дня вивария. 6.24. При обнаружении в секциях больных животных последние с ведома экспериментатора уничтожаются или переводятся в изолятор. Вопрос о дальнейшем использовании заболевших животных решается в течение не более двух суток. 6.25. Трупы животных до патологоанатомического вскрытия хранятся в специальном холодильнике не более одних суток, после чего подлежат утилизации. Хранение трупов животных в клетках и иа полу в экспериментальных секциях категорически запрещается. 6.26. Патологоанатомическое вскрытие животных производится экспериментатором. В случае гибели животного вне зависимости от эксперимента на вскрытии присутствует ветеринарный врач вивария. 6.27. Каждый случай падежа или вынужденного убоя животных должен быть зафиксирован в специальном журнале. 6.28. Запрещено посещение вивария посторонними лицами без специального разрешения. Сотрудники учреждения, выполняющие работы в виварии, обязаны: соблюдать установленные правила распорядка дня и режим работы вивария; вести систематические наблюдения за своими экспериментальными животным; вести первичную документацию, своевременно заполняя этикетки на клетках с экспериментальными животными; посещать только те помещения вивария, в которых находятся животные, закрепленные за данным сотрудником; по окончании экспериментов или любой другой текущей работы с подопытными животными оставлять рабочее место в надлежащем порядке; следить за своевременным списанием вышедших из опыта, павших или вынужденно убитых экспериментальных животных; сообщать специалистам вивария о всех замеченных случаях заболеваний экспериментальных животных, а также своевременно уведомлять специалистов вивария о предполагаемых патологических состояниях животных в соответствии с условиями эксперимента. 6.29. Сотрудникам учреждения, выполняющим работу в виварии с экспериментальными животными, запрещается давать какие-либо указания рабочим по изменению режима содержания и кормления животных без согласования со специалистами вивария. 6.30. При проведении сотрудниками данного учреждения совместных исследований на животных в других учреждениях запрещается на это время работа этих сотрудников в (клинике) виварии своего института (учреждения). 6.31. Все действия, которые могут причинить лабораторным животным боль (операции, тотальное обескровливание, вживление датчиков и т.д., а также вынужденный убой животных), должны производиться с использованием наркотизирующих средств. Если по условиям эксперимента противопоказано применение анестезии, то все вышеуказанные действия необходимо проводить в максимально короткий срок. 6.32. В ходе проведения эксперимента сотрудник, проводящий этот эксперимент, должен в обязательном порядке соблюдать следующие правила гуманного обращения с лабораторными (экспериментальными) животными. В случаях, когда предполагается хирургическое вмешательство или проведение эксперимента с болевым раздражением, анестезия должна проводиться до привязывания животного к станку. Расчет количества анестезирующего вещества должен проводиться на 1 кг или 1 г массы животного. Название вещества и его количество необходимо фиксировать не только в протоколе опыта, но и специальной карте. В ходе эксперимента, когда он оказывается более длительным, чем рассчитывалось первоначально, обязательно проводится добавочное введение анестезирующих веществ. Если острый опыт должен закончиться гибелью животного, то экспериментатор обязан умертвить животное до окончания действия анестезирующего вещества. После окончания хирургического вмешательства животное должно быть перенесено в послеоперационное помещение на специальных носилках, исключающих возможность смещения тканей, расхождения швов и т.д. Экспериментатор должен предусмотреть возможность появления болевых ощущений у животного в послеоперационном периоде и назначить обезболивающие препараты. 7. Штатная численность обслуживающего персонала вивария 7.1. Штатная численность обслуживающего персонала вивария определяется в зависимости от объема и характера экспериментальных исследований, а также от количества лабораторных животных. При этом необходимо исходить из следующих норм нагрузки животных одного вида на одного рабочего по уходу (с учетом норм размещения животных в клетках). Вид животных Число животных клеток Мыши 800 - 1000 80 - 100 Крысы 600 - 700 80 - 100 Хомяки 60 - 70 Морские свинки 50 - 70 Кролики Собаки 18 - 20 18 - 20 Кошки 35 - 40 При обслуживании одним человеком животных нескольких видов расчет проводится, исходя из приведенных выше норм. В каждом конкретном случае при установлении норм нагрузки по уходу за животными на одного рабочего необходимо учитывать тип клеток, степень механизации производственных процессов, тип кормления (натуральные корма или гранулированные), периодичность, характер и особенности проводимых исследований и т.д. 7.2. При работе с радиоактивными веществами или особо опасными инфекциями, а также при содержании видов животных, не указанных в табл. , нормы обслуживания устанавливаются руководителем научного учреждения на основе хронометража отдельных операций и с учетом действующих нормативов по обслуживанию сельскохозяйственных животных. 8. Правила личной гигиены сотрудников вивария 8.1. Персонал вивария должен быть обеспечен спецодеждой, спецобувью, мылом и полотенцами в соответствии с действующими нормативами. 8.2. В комнатах с животными, кормокухне, дезинфекционно-моечном отделении необходимо иметь дезинфицирующие растворы для обеззараживания рук. 8.3. Персонал вивария обязан: перед началом работы снять верхнюю одежду, обувь, надеть спецодежду, спецобувь; по окончании работы (желательно и до начала работы) пройти обработку в санитарном блоке (принять душ или ванну); вешать домашнюю одежду и спецодежду только в разных отделениях индивидуального шкафа; периодически (но не реже одного раза в месяц) дезинфицировать свои индивидуальные шкафы; по окончании каждого отдельного этапа работы в соответствии с распорядком дня, а также перед приемом пищи обязательно мыть и дезинфицировать руки. 8.4. В производственных помещениях вивария категорически запрещается принимать пищу и курить. 8.5. Вновь принятые на работу с лабораторными животными лица должны пройти медицинское обследование, включающее в себя исследования на наличие возбудителей туберкулеза и всей группы кишечных инфекций. Последующие обследования проводятся не реже одного раза в год. Больные туберкулезом, венерическими, кожными и другими заразными заболеваниями к работе в виварии не допускаются. 8.6. При проведении на животных экспериментов с инфекционными возбудителями, опасными для людей, обслуживающий персонал вивария подвергается профилактической иммунизации.			Метод фиксации
Крупный рогатый скот	Животного укрощают путем сдавливания носовой перегородки пальцами, щипцами Гармса, Николаева, носовыми кольцами или ограничивают движения, удерживая его за рога с помощью веревки, за шею, голову и второй петли вокруг носа. Задние конечности фиксируют веревочной петлей, которую накладывают на обе конечности несколько выше скакательных суставов. При расчистке и обрезке копыт на тазовые конечности животных можно наложить закрутку на голень. Быков фиксируют с помощью носовых колец и прочного ремня-ошейника с цепью.
	Быков-производителей независимо от их нрава доставляют на обследование только на недоуздке и обязательно применяют палку-водило (карабин) длиной около 2 м, которую прицепляют за носовое кольцо, что предупреждает внезапное нападение животного на человека. Телят удерживают руками за шею, уши или с помощью шейной глухой петли со специальным узлом и привязывают веревкой к стойке.
Свиньи	Животных фиксируют в стоячем положении путем захвата верхней челюсти металлическим тросом и ручкодержателем или в станке несложной конструкции. Откормочный молодняк и подсвинков удобно удерживать щипцами, предложенными К.П. Соловьевым. При работе с хряками, старыми боровами и кормящими свиноматками, особенно фиксированными в станках, требуется осторожность.
Козы и овцы	Животных удерживают за рога или шею. В необходимых случаях фиксируют в лежачем положении на столе.
Лошади	Лошадей фиксируют так, чтобы они не могли ударить передними и задними конечностями, укусить. К лошадям следует подходить несколько сбоку, в направлении плеча и лопатки, лучше с левой стороны, поскольку лошадь привыкает к этому в процессе эксплуатации. Подходят к голове, левой рукой берут за недоуздок, уздечку или гриву, а правой - поглаживают и похлопывают по шее, холке, затем по лопатке и плечу. Если животное содержится без привязи в деннике, то его следует окликнуть, чтобы привлечь внимание к себе, подозвать, произнося ласковые слова. Необходимо, чтобы лошадь обязательно встала головой к человеку. К находящемуся в станке или на коновязи животному следует подходить не сзади, а несколько сбоку с той стороны, куда оно смотрит. При термометрии, ректальном исследовании, проведении различных лечебных манипуляций с целью обеспечения безопасности работы ветеринарного специалиста необходимо поднять грудную конечность с той стороны, с которой манипулирует специалист, или наложить путки на одну или обе задние конечности.
	Грудную конечность фиксируют, подняв за щетку или путовую часть и согнув в запястном суставе. При этом встают сбоку от животного спиной к его голове. Поднятую конечность удерживают двумя руками, а при длительных манипуляциях - с помощью путки или веревки, перекинутой через спину. Нельзя класть поднятую конечность животного на свое колено, так как у животного появляется четвертая точка опоры, что небезопасно для человека. Не следует привязывать веревку к какому-либо предмету или обматывать вокруг туловища животного, так как при неожиданном падении лошадь не сможет быстро высвободить конечность. При обследовании задних частей тела фиксируют тазовую конечность. Встав у крупа лошади лицом к хвосту, одной рукой опираются в маклок, а другой легко похлопывают по ноге сверху вниз, поднимают ее, застегивают путовый ремень или надевают веревочную петлю, которую затем пропускают между передними конечностями, обводят вокруг шеи и завязывают нестягивающейся петлей. При исследовании строптивых и для укрощения беспокойных лошадей применяют закрутки и губные клещи. Чтобы наложить закрутку, надо ввести кисть руки в петлю закрутки. Захватить верхнюю губу, оттянуть ее вперед, левой рукой переместить петлю закрутки на губу и туго закрутить. Животных можно надежно фиксировать в специальных станках. В станке лошадь рекомендуется привязывать на растяжку, а строптивому животному, чтобы оно не завалилось, под живот подвести ремни.
Верблюды	Верблюды доставляются для исследований на недоуздке. Подходить к верблюдам надо осторожно, лучше сбоку (со стороны грудных конечностей). Способы укрощения этих животных такие же, как крупного рогатого скота и лошадей. Следует учитывать специфические особенности поведения этих животных. Желательно, чтобы для фиксации верблюдов привлекался персонал, постоянно ухаживающий за ними.
Птица	Птицу фиксируют, удерживая в естественном положении за конечности и крылья, не сдавливая грудную клетку, чтобы избежать удушья. При работе с водоплавающими (гуси, утки) нужно удерживать и голову, чтобы избежать удара в глаз, а манипуляции проводить на расстоянии вытянутых рук.
Пушные звери	Зверей удерживают специальными щипцами или руками в брезентовых (с ватной подкладкой) рукавицах. Кладут на стол и держат одной рукой за шею, другой - за туловище. Ротовую полость можно раскрыть с помощью зевников конструкции В.Л. Берестова, рекомендуется использовать специальные намордники. Можно фиксировать животных в сетчатых ловушках, применять анальгезирующие или транквилизирующие средства с местно-анестезирующими веществами, а также средство для наркоза.
Собаки	При помощи хозяина на животных надевают намордник или завязывают им ротовую полость крепкой тесьмой. С этой целью на челюсти сверху накладывают тесьму, завязывают простым узлом под нижней челюстью, затем окончательно закрепляют на затылке морским узлом. При подозрении на бешенство, а также злых и беспокойных собак лучше поместить в специальную металлическую клетку, одна сторона которой передвигается и зажимает ее. Для фиксации собак в лежачем положении используют операционный стол для мелких животных, позволяющий придать им любое удобное для работы положение.
Кошки	При болезненных манипуляциях животных фиксируют в специальном матерчатом рукаве или обертывают полотенцем, оставляя свободной часть тела, подлежащую исследованию. Морду можно завязать, как собаке, а ноги зафиксировать руками, надев кожаные или резиновые перчатки.

СНиП 11.01-2003. Инструкция о порядке разработки, согласования, утверждения и состава проектной документации на строительство предприятий, зданий и сооружений.

. СаНПиН 2.2.1/2.1.1.1200-03 . Санитарно-защитные зоны и санитарная классификация предприятий, сооружений и других объектов (Новая редакция. Утверждена постановлением Главного санитарного врача РФ № 74 от 25.09.07, зарегистрирована Министерством юстиции РФ № 10995 от 25.01.08).

Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

В ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ

В методических рекомендациях проанализированы возможности использования различных видов лабораторных животных в токсикологических экспериментах, представлены основные типы токсикологических исследований и способы введения химических веществ при их осуществлении; приведены варианты моделирования алкогольной интоксикации; обоснованы принципы моделирования комбинированного воздействия хронической алкогольной интоксикации и алиментарной недостаточности.

Методическое пособие составлено,

К.В. Шелыгиным, д.б.н.

И.А. Кирпич, доц.

В.Я. Леонтьевым, проф.

А.Г. Соловьевым.

под редакцией проф., академика РАМН П.И. Сидорова.

Рецензент: зав. кафедрой биологии и экологи человека и животных Поморского государственного университета им. Ломоносова, д.б.н., проф. В.А. Барашков

1. Моделирование острых и хронических токсических эффектов– важное направление клинической токсикологии

2. Основные лабораторные животные, используемые в токсикологических исследованиях

2.1 Грызуны

2.3. Крупные млекопитающие

3. Острые, подострые и хронические эксперименты в токсикологии

4. Способы введения токсических веществ

5. Моделирование острой и хронической алкогольной интоксикации

6. Моделирование комбинированного воздействия хронической алкогольной интоксикации и алиментарной недостаточности

Литература

1. МОДЕЛИРОВАНИЕ ОСТРЫХ И ХРОНИЧЕСКИХ ТОКСИЧЕСКИХ

ЭФФЕКТОВ – ВАЖНОЕ НАПРАВЛЕНИЕ КЛИНИЧЕСКОЙ ТОКСИКОЛОГИИ

Одно из основных направлений современной токсикологии напрямую связано с исследованием патологических изменений организма при острых и хронических токсических воздействиях.

Большую помощь в изучении механизмов развития морфофункциональных осложнений острой и хронической интоксикации могут оказать эксперименты на лабораторных животных, поскольку прямые исследования не всегда возможны, а порой и этически недопустимы. Разумеется, экстраполяция экспериментальных данных на патологию человека в рамках развития положений клинической токсикологии требует определенной осторожности ввиду известных особенностей протекания метаболических процессов у животных, функциональных характеристик их внутренних органов, а подчас и существенных отличий в строении организма. Тем не менее, опыты на животных позволяют проследить динамику патологических изменений в органах и составить представление о развитии патологических процессов на системном, органном, клеточном и субклеточном уровнях, что является необходимым условием для разработки эффективных методов профилактики и лечения отравлений различной этиологии.

При проведении эксперимента необходимо руководствоваться принципами гуманного отношения к животным в соответствии с Международными рекомендациями (1993), а так же с соблюдением биоэтических норм и требований Международного комитета по науке (1978).

В соответствии с диффиренцированными задачами моделирования эффектов токсического воздействия химических соединений эксперименты могут проводиться на различных лабораторных животных, наиболее распространенными видами среди которых в токсикологических исследованиях являются грызуны, птицы и крупные млекопитающие.

2. ОСНОВНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ,

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

2.1. Грызуны.

При моделировании токсических эффектов химических веществ наиболее часто используются грызуны (мыши, крысы, морские свинки, кролики).

Белые лабораторные мыши, являющиеся альбиносами домашней серой мыши, используются для определения токсичности химических веществ, стандартизации фармакологических препаратов.

Морские свинки являются классическим объектом для изучения аллергогенности химических веществ, а так же проявлений авитаминозов. Изолированные органы этих животных применяются в фармакологических исследованиях.

Кролики в связи с особенностями протекания у них овуляторного цикла и высокой скоростью размножения удобны для выявления воздействия токсических веществ на репродуктивные функции.

Лабораторные крысы (альбиносы черной и серой крыс) являются наиболее распространенным видом экспериментальных животных для разработки моделей последствий острых и хронических интоксикации. В настоящее время выведено более 100 отдельных аутобредных стоков и инбредных линий лабораторных крыс. Наиболее часто при токсикологических исследованиях используются крысы стоков Wistar, Bio Breeding Sprague-Dawley, C57BL, CFI, C3H и др. Отдельно выделяют конвенциональных (беспородных) животных, микрофлора которых полностью или частично неизвестна.

Удобство использования крыс для исследования токсических эффектов химических и биологических препаратов объясняется простотой их содержания, возможностью размещения на сравнительно небольшой территории достаточного количества животных, небольшим весом, устойчивостью к инфекционным заболеваниям, большим приплодом, который они дают. Крыс легко фиксировать рукой; постоянная заполненность желудка пищей при обычном режиме питания позволяет вводить им интрагастрально достаточные дозы токсических агентов, не вызывая катаральных изменений слизистой. Предпочтение в токсикологических исследованиях отдается самцам, так как они не имеют гормональных колебаний, способных оказывать влияние на мембранотропное действие ядов; целесообразнее использование молодых животных, поскольку у них меньше толерантность к различным токсическим веществам.

Наиболее часто при проведении токсикологических экспериментов используются куры, утки, гуси, индейки. Отдельно выделяют птиц - свободных от специфических патогенных микроорганизмов (specific pathogen free - SPF).

Птицы являются удобной моделью для проведения исследований влияния химических веществ на метаболические процессы, поскольку они протекают более интенсивно и быстрее, чем у других животных. Однако, при проведении исследований необходимо учитывать некоторые анатомо-физиологические особенности строения организма птиц. Так, например, у последних нет потовых и сальных желез, а так же мочевого пузыря, что имеет существенное значение для определения клиренса выведения токсических агентов и их метаболитов. Состав крови и мочи птиц существенно отличается от соответствующих физиологических показателей других животных. В отличие от млекопитающих птицы имеют особенности в строении желудочно-кишечного тракта, у них по-другому протекают процессы переваривания корма. В исследованиях на птицах удовлетворительным критерием является изменение массы тела.

При исследовании влияния токсических веществ на поведенческую активность необходимо учитывать, что реактивность птиц зависит от принадлежности их к яйценоской или мясной направленности, а также от степени их продуктивности.

При недостаточном освещении птицы не подходят к кормушкам и поилкам, поэтому, если по условиям эксперимента необходимо повысить потребление корма или жидкости, которые содержат токсическое вещество, используется искусственное освещение. Содержать птиц при проведении эксперимента рекомендуется группами, поскольку в этом случае они достигают большей массы и более резистентны к инфекциям.

2.3. Крупные млекопитающие.

Проведение токсикологических исследований на крупных млекопитающих (собаках, кошках, обезьянах) обусловлено наибольшей схожестью строения и функционирования их внутренних органов и систем, а также метаболических процессов с таковыми у человека.

Обезьяны, несмотря на сложность их содержания, используются в токсикологической практике при изучении влияния химических веществ на функции центральной нервной системы.

Кошки, как объект исследования чаще всего применяются в острых токсикологических экспериментах. Кроме того, их изолированные органы задействуют в целях выявления физиологических изменений при действии химических веществ.

Одним из часто используемых в клинической токсикологии крупных млекопитающих животных являются собаки. Для проведения токсикологических экспериментов наиболее пригодными считаются беспородные короткошерстные собаки со средней массой тела 10-15 кг, поскольку чистопородные и линейные животные более прихотливы в содержании и гораздо нестойки в хронических опытах. Оптимальный возраст животных 1,5-5 лет. Известно, что основные морфофункциональные изменения у собак при проведении токсикологических исследований во многом соответствуют таковым у человека.

В условиях проведения эксперимента необходимо учитывать, что собаки являются стайными животными с развитой иерархической системой, половыми и индивидуальными различиями темперамента, поэтому рекомендуется одиночное размещение собак в отдельных боксах. Собаки достаточно легко обучаются, что можно использовать при проведении некоторых процедур, ограничивая применение средств фиксации.

Кормление животных осуществляется согласно разработанным рационам и с учетом задач эксперимента. Однако, необходимо помнить, что желудочно-кишечный тракт собак не приспособлен к перевариванию большого количества растительной пищи.

3. ОСТРЫЕ, ПОДОСТРЫЕ И ХРОНИЧЕСКИЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ В ТОКСИКОЛОГИИ

Выбор продолжительности эксперимента при изучении токсических свойств изучаемых веществ определяется целями исследования (таблица 1).

Острый токсикологический эксперимент используется для моделирования острой токсичности вещества, проявляющейся после его однократного или повторного введения через короткие (не более 6 часов) интервалы в течение суток. Целями изучения острой токсичности являются определение безвредных, токсических, летальных доз вещества, его способности к кумуляции, а также причин гибели животных.

Подострый эксперимент проводится для определения допустимых условий воздействия, оптимальных суточных доз, для выбора доз в хроническом эксперименте.

Исследование токсических свойств веществ в субхроническом и хроническом экспериментах осуществляется с целью установления степени их повреждающего действия при длительном введении, определения уровня обратимости вызываемых ими повреждений, а так же выявления наиболее чувствительных к токсическому действию органов и систем организма.

Таблица 1 Продолжительность и цели токсикологического эксперимента
Характер эксперимента	Продолжительность	Цели эксперимента
	Однократное введение;	Определение смертельных доз, среднего времени гибели, порога острого действия химических веществ
Подострый	2-8 недель	Определение кумуляции, аллергического действия, влияния на репродуктивную функцию химических веществ
Субхронический	13-18 недель	Определение пороговой дозы общетоксического действия при установлении ПДК веществ в воздухе
Хронический	6-12 месяцев	Определение пороговой дозы общетоксического действия при установлении ПДК веществ в воде и пище
Пожизненный	от 1 года и более	Определение пороговой дозы общетоксического действия химических веществ

4. СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ ТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ

Для формирования характерных токсически обусловленных патологических изменений у животных используются добровольные, полудобровольные и принудительные способы введения токсических веществ.

На добровольный выбор животными потребляемых жидкостей или сухих кормов влияют индивидуальная чувствительность, скорость метаболизма вещества, порода, возраст, условия содержания, наличие дополнительных стрессорных факторов, концентрация раствора, наличие пищевых добавок и т.д. Данный способ не может обеспечить достаточно высоких и стабильных доз поступления токсических веществ в организм, поэтому более эффективными являются модели полудобровольного и принудительного введения.

При полудобровольном способе животные имеют возможность самостоятельно регулировать количество потребляемого вещества. К ним, в частности, относится методика предоставления раствора исследуемого вещества в качестве единственного источника жидкости.

Способы принудительного введения позволяют обеспечить массивную токсическую нагрузку, что обусловливает высокую концентрацию агента в крови и приводит к быстрому развитию патологических изменений.

При изучении токсически обусловленной патологии особое значение придается способам, характеризующимся моделированием тех концентраций токсических веществ, которые встречаются в реальных условиях. Этим параметрам, например, соответствует способ интрагастрального введения этанола, при котором средние дозы спирта, получаемые животными на протяжении эксперимента, составляют, обычно, 4-10 г/кг в сутки.

Ингаляционный метод введения веществ позволяет создавать практически любые токсические нагрузки. В то же время, принудительная продувка токсических веществ через затравочную камеру требует значительного расхода химических ингредиентов, а постоянную их концентрацию создать, практически, невозможно. Существующий способ разлива химического вещества в камере, где находятся животные, более пригоден для моделирования острых отравлений, однако, при данном способе невозможен количественный токсикологический контроль в условиях работы с несколькими веществами одновременно.

Наиболее рациональным при использовании способа ингаляционного введения, является тот, при котором для принудительной продувки через затравочную камеру используется только чистый воздух. Исследуемые вещества при этом расположены внутри камеры в небольших сосудах, площадь открытого участка которых подбирается расчетным образом. Заменяя сосуды на более узкие или широкие, можно варьировать скорость испарения химических соединений, количество которых берется с таким учетом, чтобы по окончанию затравки какое-то содержимое их осталось в сосудах. Данный способ прост в применении, обладает высокой чувствительностью, позволяет точно создавать постоянную концентрацию, значительно экономить используемые химические вещества.

Выбор концентраций и доз химического соединения решается с учетом целей эксперимента и физиологических особенностей подопытных животных. Необходимо помнить, что количество вводимых растворов ограничивается рамками физиологических возможностей, массой и возрастом животных. Так, максимальные объемы введения у крыс составляют интраназально до 0,4 мл, ректально – 1 мл, внутрикожно – 0,04 мл, подкожно – 10 мл, внутримышечно и внутрибрюшинно – до 5 мл, внутривенно – 6 мл, внутрисердечно – 1 мл, субокципитально – 0,15 мл, интрагастрально при весе тела 100-190 г – 3 мл, 200-290 г – 4-5 мл, 250-300 г – 6 мл, 300 г и более – 8 мл. Максимальные объемы веществ у собак составляют при интраназальном введении – 4 мл, подкожном – 20 мл, внутримышечном – 12 мл, внутрибрюшинном – 20 мл.

В то же время, введение веществ животным производится с учетом особенностей их анатомии, а так же формы исследуемого вещества. Например, порошкообразные - вводятся крысам перорально, путем приготовления пилюль из данного вещества и муки, хлеба или его добавления к воде или корму.

Введение растворов веществ осуществляется перорально с помощью резинового или металлического зонда, интраназально с помощью мочевого катетера, ректально. Кожное введение подразумевает предварительное удаление волосяного покрова, выполнение насечек, после чего наносят исследуемое вещество. Внутрикожные инъекции осуществляют в задней части спины или на животе, предварительно так же удалив волосяной покров. Подкожные инъекции делают на шее, спине или животе. Внутримышечно вещества вводят в заднебедренные мышцы. Внутрибрюшинные инъекции выполняют в левый нижний квадрант брюшной полости. Внутривенно вещества вводят в хвостовую вену или в дорсальную вену полового члена. Введение веществ также возможно непосредственно в сердце, либо субокципитально предварительно анестезированной крысы.

Введение токсических веществ птицам осуществляется интрагастрально при помощи зонда, внутривенно в локтевую или плечевую вену крыла, внутрибрюшинно в правый нижний квадрант брюшной полости, подкожно через кожу на животе или внутримышечно через четырехглавую мышцу бедра.

Введение исследуемых веществ собакам выполняется путем их подмешивания к корму, питьевой воде, либо принудительно, когда вещество в виде таблетки кладется на спинку языка животного. Жидкие вещества, а так же растворы вводят при помощи ложки или спринцовки, однако более удобно использовать желудочный зонд. Кроме того, введение жидких веществ возможно интраназально с помощью катетера, ректально, подкожно в области спины, бедра или затылка, внутрикожно, накожно, внутримышечно – в мышцы бедра, внутривенно – в вены голени, стопы, предплечья, внутрибрюшинно. Существуют способы субокципитального, внутримозгового и внутрисердечного введения веществ, однако, их выполнение сопряжено с техническими трудностями и подвергает повышенной угрозе жизнь животного.

Для снижения трудностей, возникающих при экспериментальном изучении токсических свойств веществ, проявляющихся в необъективности подбора доз, их вариабельности, используется метод экспериментального изучения токсичности малотоксичных соединений, путем введения доз, соответствующих максимально возможному разведению химических соединений в известных максимально вводимых объемах, .позволяет быстро подобрать максимальную вводимую дозу на кг (г) веса животного, подтвердить или опровергнуть низкую токсичность изучаемых веществ, сравнить результаты различных исследователей между собой.

5. МОДЕЛИРОВАНИЕ ОСТРОЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

Социологические исследования, проведенные в последние десятилетия, показывают стабильно высокий уровень распространенности как злоупотребления алкоголем, так и алкоголизма и его осложнений среди различных групп населения. В то же время, при проведении эпидемиологических исследований влияние множества социальных факторов не позволяет до конца выявить искомые зависимости течения различных проявлений алкоголизма. Поэтому одним из способов исследования алкогольобусловленной патологии в клинической наркологии является моделирование проявлений острой и хронической алкогольной интоксикации на лабораторных животных.

При моделировании острой алкогольной интоксикации используются максимально переносимые дозы этанола. В этом случае исследуются патологические изменения, сопровождающие развитие острого отравления вплоть до коматозного состояния.

Моделирование хронической алкогольной интоксикации позволяет получить характерные патологические изменения, сравнимые с таковыми у человека при длительном злоупотреблении алкоголем. При применении методик с длительным введением алкоголя необходимо учитывать возрастной фактор, так как скорость элиминации этанола из организма с постарением животных замедляется.

Средние дозы этилового спирта, получаемые животными на протяжении хронического эксперимента, зависят от его задач и составляют, например, для крыс - от 4-10 г на кг веса в сутки, но иногда используются и максимально переносимые дозы – до 15 – 20 г/кг. Наиболее адекватной для моделирования характерных проявлений алкогольной висцеропатологии на крысах, являются дозы в пределах 7 г/кг/сут. 40% этанола, соответствующие, в частности, ? DL50, что обусловливает в процессе хронической интоксикации достаточно быстрое развитие типичных алкогольных поражений внутренних органов, но не сопровождается массовой гибелью животных. Продолжительность хронического эксперимента колеблется от 5 суток до 4 лет также в зависимости от целей исследования.

6. МОДЕЛИРОВАНИЕ КОМБИНИРОВАННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ И АЛИМЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

Ряд клинических синдромов алкоголизма связывается с нарушением питания (в частности, обмена витаминов и белков) и изменением нутриентного статуса организма. Это обусловлено тем, что продолжительная алкогольная интоксикация в ряде случаев сопровождается недостаточностью питания, нарушением всасывания и метаболизма незаменимых факторов питания.

Ввиду того, что этанол, помимо высокой калорийности, не представляет пищевой ценности, при систематическом употреблении алкогольных напитков структура пищевого рациона претерпевает резкий дисбаланс, при этом часто наблюдается алиментарный дефицит, подобный дефициту при голодании. Нарушение обмена белков и общая белковая недостаточность при хронической алкогольной интоксикации достаточно обоснованно расцениваются как одни из типичных для рассматриваемой патологии проявлений. Недостаток отдельных факторов белкового питания может вызвать существенные нарушения обмена витаминов, что, в свою очередь, приводит к ухудшению функциональной активности внутренних органов. Поскольку некоторые из витаминов оказывают избирательное действие на отдельные их функции, хроническая алкоголизация еще более углубляет эти нарушения. Кроме того, при одновременном дефиците витаминов и белка морфофункциональные параметры могут отличаться от соответствующих характеристик изолированных форм алиментарной недостаточности.

На основании вышеизложенных данных, нами предложена модель комплексного воздействия хронической алкогольной интоксикации и алиментарной недостаточности - витаминов группы В, играющих важную роль при алкогольобусловленной патологии, и белка.

Алгоритм создания модели.

Алгоритм создания экспериментальной модели хронической алкогольной интоксикации на фоне алиментарного дисбаланса включает следующие компоненты:

1.Выбор лабораторных животных и условий их содержания

2. Выбор экспериментальных диет, необходимых дозировок этанола, способа его введения и продолжительности эксперимента

3.Оценка степени тяжести токсического воздействия.

Выбор лабораторных животных и условий их содержания

В качестве подопытных животных при моделировании длительной алкоголизации на фоне алиментарного дисбаланса при прочих равных условиях предпочтительнее использовать крыс. Выбор данного вида лабораторных животных обусловлен сравнимостью алкогольобусловленных изменений у крыс с таковыми у человека, морфофизиологическими особенностями этих животных (отсутствием отвращения к этанолу и рвотного рефлекса на его действие, постоянной заполненностью желудка пищей), простотой содержания и легкостью выполнения с ними различных процедур (фиксации, введения растворов веществ с помощью зонда и т. д.).

Животные должны содержаться в стандартных условиях вивария, иметь свободный доступ к пище и воде. Учитывая возможность поступления витаминов при копрофагии, крыс содержат в клетках с дном из крупноячеистой сетки.

Выбор экспериментальных диет, необходимых дозировок этанола, способа его введения и продолжительности эксперимента

Для наиболее полного изучения комплексного воздействия недостаточности витаминов группы В и белка животных рекомендуется разделить на четыре рабочие группы, получающие:

I – сниженное содержание витаминов группы В

II – сниженное содержание белка

III – сниженное содержание белка и витаминов группы В

IV – контрольная – содержится на обычном рационе вивария.

Например, рацион, практически исключающий содержание витамина В6 содержит 18-20% казеина, очищенного от витаминов, 73-71% сахарозы, 4% солевой смеси, 3% подсолнечного масла с 0,2% рыбьего жира.

При проведении эксперимента, в цели которого входит моделирование недостаточности определенных витаминов, следует максимально точно обеспечивать покрытие потребностей животных в других витаминах (таблица 2).

Таблица 2 Суточные дозы витаминов, покрывающие основные потребности крыс (по Ю.М. Островскому, 1979).
	Суточная доза, мкг
Пантотенат
Пиридоксин
Витамин С
Токоферол

В связи с изменением массы тела животных рационы необходимо корректировать в соответствии с приказом МЗ РСФСР №1179 от 10. 10. 1983 «Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения».

Моделирование недостаточности в рационе белка осуществляется путем содержания лабораторных животных на специализированных диетах, составленных по методике А.А. Покровского с соавт. (1974).

Наиболее приемлемой в условиях хронического эксперимента на крысах является экспериментальный рацион, содержание белка в котором в 4,6 раза меньше, чем при стандартном кормлении (таблица 3).

Таблица 3 Суточный рацион крыс с пониженным содержанием белка (по А.А. Покровскому, 1974)
Ингредиенты		% по калорийности
Казеин пищевой
Смесь лярда и подсолнечного масла 1:1
Крахмал маисовый

Для достижения равной калорийности между стандартным и экспериментальным рационами к последнему добавляют расчетное количество крахмала.

В каждой группе животные разделяются не менее чем на две подгруппы:

Получающие ежедневно 40 % раствор этанола через металлический желудочный зонд (из расчета 7,0 г/кг веса) .

Получающие эквиобъемное количество дистиллированной воды.

Введение раствора этанола и дистиллированной воды производится ежедневно в утренние часы до кормления.

Для изучения алкогольобусловленной патологии у крыс продолжительность эксперимента составляет от 4 до 6 недель.

Оценка степени тяжести токсического воздействия

Для адекватной оценки токсического действия химических веществ необходимо регулярное наблюдение за животными, во время которого отмечаются потребление корма и воды, изменение внешних признаков (волосяного покрова, видимых слизистых), особенности поведения. Не реже 1 раза в неделю для изучения динамики изменений производится взвешивание, исследуется функциональное состояние внутренних органов и систем, биохимические и морфологические изменения крови. Методы для оценки состояния органов и систем выбираются с учетом целей эксперимента, однако они должны быть современными и достаточно чувствительными. При проведении исследования необходимо стремиться к использованию максимально полного набора физиологических, патоморфологических, гематологических и биохимических тестов, как для интегральной оценки состояния, так и для определения степени нарушения отдельных органов и систем.

Степень выраженности патологических изменений, регистрируемых у животных, подвергающихся длительной алкогольной интоксикации на фоне алиментарного дисбаланса, определяется с помощью анализа интегральных, биохимических, гематологических и оценки патоморфологической картины. Для проведения функциональной диагностики состояния внутренних органов используются инструментальные методы – ЭЭГ, ЭКГ.

Интегральные показатели:

*изменение внешних признаков – производится 1 раз в 3 суток, перед очередным введением этанола или дистиллированной воды, путем бальной оценки изменения окраса шерсти и волосяного покрова по следующей схеме (таблица 4):

Таблица 4 Шкала изменений внешних признаков крыс
	Баллы или символы	Описание изменения
		Выпадение шерсти
		Загрязненный
		Не загрязненный

*изменение степени активности - оценивается в баллах 1 раз в 3 суток до этанольной затравки или водной нагрузки по следующей схеме (таблица 5)

*изменение массы тела животных - регистрируется путем взвешивания через каждые 7 суток эксперимента до закладки корма и этанольной затравки

*объем суточного потребления пищи и воды; экскреция веществ.

Шкала изменения активности крыс в токсикологическом эксперименте

Баллы, символы /+/	Степень активности	Описание активности
		Погибшее животное
	Кома (отсутствие активности)	Боковое положение; обездвиженность; отсутствие активных движений; мышцы расслаблены; дыхание прерывисто; реакции на болевые и тактильные раздражители, в том числе и голосовые, практически отсутствуют.
	Слабая (минимальная)	В основном – боковое положение; непроизвольные слабые активные движения; мышцы расслаблены; вялая реакция на болевые и тактильные раздражители, голосовая – слабая.
	Пассивная	Животное заторможено, активно по клетке не передвигается, но при подталкивании перемещается на несколько шагов. Положение естественное – на четырех лапах; ощущается тонус мышц. «Избегательная» защитная реакция на раздражители, голосовая реакция слабая.
	Замедленная (субнормальная)	Положение – на четырех лапах, медленные активные движения – повороты туловища и небольшие передвижения по клетке, редкие глотательные движения. Реакция на болевые и тактильные раздражители – голосовая и «избегательно-оборонительная» с попытками укусов. При фиксировании рукой за кожу в области спины - изворачивается с «уходом» от экспериментатора.
	Нормальная	Интактная крыса. Подвижна; активные движения - перемещение и «изыскание лучшего места в группе»; «настороженно-ожидательная» поза при незначительных болевых и тактильных раздражителях с избеганием, резкой голосовой и активно-оборонительными реакциями, царапающими и кусательными движениями. Хороший аппетит; частые «моющие» движения лапками.

Биохимические и гематологические показатели.

Исследуются изменения основных биохимических показателей крови и совокупности гематологических параметров, подвергающихся наибольшему влиянию хронической алкогольной интоксикации (таблица 6).

Таблица 6 Биохимические и гематологические показатели крыс в токсикологическом эксперименте
Объект исследования	Исследуемые показатели
Сыворотка крови	аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза, креатининфосфокиназа, гамма-глутамилтрансфераза общий белок, белковые фракции креатинин мочевина
Форменные элементы крови	количество эритроцитов гематокритная величина цветной показатель количество ретикулоцитов средняя продолжительность жизни эритроцитов лейкоцитарная формула

Подготовка гистологического материала.

Гистологическому исследованию подвергаются основные «органы – мишени» хронической алкогольной интоксикации – сердце, печень, почки, головной мозг. Необходимо помнить, что качество анализа во многом зависит от подготовки материала, в частности, фиксации исследуемых объектов. Рекомендуется использование для фиксации 10 % раствора формалина или раствор Буэна. При этом предпочтение отдается раствору Буэна, поскольку в данном случае значительно лучше выявляются изменения микроструктуры органов, свойственные длительной алкогольной интоксикации, а именно:

1) в печени – четче прослеживается структурированность цитоплазмы (вакуолизация, «булыжность» - неоднородность прокрашивания цитоплазмы клеток внутри долек), особенности изменения кровенаполнения центральных вен гемокапилляров;

2) в почках – в морфологии эпителиальной выстилки канальцев отчетливее отражаются неоднородности цитоплазматических структур с особенно частым поражением апикальных частей;

3) в легких – в соединительно-тканных межальвеолярных перегородках значительно резче выявляются гипертрофированные, со светлой цитоплазмой клетки, часть которых становится полиплоидными. Чаще отмечаются изменения со стороны альвеолярного эпителия, клетки которого слущиваются в просвет альвеол;

4) в селезенке – лучше проявляется структура ретикулярных клеток, синусов красной пульпы, где отмечается большее разрушение эритроцитов.

Таким образом, применение модели алкогольобусловленной патологии на фоне алиментарного дисбаланса предполагает изучение в экспериментальных условиях наиболее широкого круга изменений внутренних органов и систем, сравнимых с таковыми у человека при злоупотреблении алкоголем. Система оценки основных интегральных, биохимических, гематологических показателей и особенностей патоморфологической картины позволяет на протяжении всего периода исследования контролировать характер и степень патологических изменений.

ЛИТЕРАТУРА

1. Берзиня Н.И. Птицы в эксперименте // Лабораторные животные. – 1995. – V. - №2. – С.99-113.

2. Регламентация экспериментов на животных – этика, законодательства, альтернативы. / Под ред. Н. А. Горбуновой. – М., 1998.

5. Мяленкова И.Ю. Лабораторная собака // Лабораторные животные. – 1994. – IV. - №4. – С.234-246

6. Нужный В.П. Методологические аспекты оценки токсичности спиртосодержащих жидкостей и алкогольных напитков // Токсикологический вестник. – 1999. - №4. – С2-10.

7. Островский Ю.М. Экспериментальная витаминология. – Минск, 1979. – 450с.

8. Покровский А.А. с соавт., О соотношении между содержанием свободных аминокислот в тканях и плазме крови при белковой недостаточности в эксперимента // Вопросы питания – 1974. - №1. – С.8-15.

9. Требования Международного комитета по науке по использованию в экспериментальных исследованиях лабораторных животных // Бюллетень ИКЛАС. – 1978. - № 24. – С. 4-5.

10. Штефель В.О. О сроках воздействия при моделировании интоксикаций в токсиколого-гигиенических исследования // Гигиена и санитария. – 1996. - №8. – С.70-72.

11. Sos J et al., Diets for animals experiments. – Budapest,1974.

Действующий

МУК 4.2.2939-11

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней

Дата введения: с момента утверждения

1. Разработаны Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора (В.В.Кутырев, И.Н.Шарова, Н.А.Осина, Е.С.Казакова, Е.А.Плотникова, С.А.Пионтковский, Т.Ю.Красовская, Д.В.Уткин, С.А.Щербакова); Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Иркутский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора (С.В.Балахонов, Т.И.Иннокентьева, М.В.Чеснокова, А.В.Мазепа, С.А.Татарников); Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора (А.Н.Куличенко, О.В.Малецкая, Т.В.Таран, А.П.Бейер, А.В.Таран); Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора (В.В.Алексеев, А.В.Липницкий, В.А.Антонов, Д.В.Викторов); Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора (Н.В.Павлович, Н.Л.Пичурина, Н.В.Аронова, Н.Н.Оноприенко, М.В.Цимбалистова, А.С.Водопьянов); Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Противочумный центр" Роспотребнадзора (В.Е.Безсмертный, С.М.Иванова); Федеральным бюджетным учреждением здравоохранения "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (В.Г.Сенникова, М.В.Зароченцев, В.В.Мордвинова); Федеральным государственным учреждением науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Роспотребнадзора (И.А.Дятлов, А.Н.Мокриевич, С.Ф.Бикетов, М.В.Храмов, Н.И.Лунева); Федеральным государственным бюджетным учреждением "ГИСК им. Л.А.Тарасевича" Минздравсоцразвития (И.В.Борисевич, Л.В.Саяпина).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 14 июля 2011 г.

1. Область применения

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания определяют порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней, формы и методы их взаимодействия, номенклатуру и объем исследования, требования к лабораториям, специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований, материально-техническому обеспечению исследований, к биологической безопасности проведения работ.

1.2. Настоящие методические указания предназначены для специалистов бактериологических лабораторий учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор за туляремией в Российской Федерации, лечебно-профилактических и противочумных учреждений.

2. Нормативные ссылки

2.1. Федеральный закон от 3*.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" .
______________
Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" . - Примечание изготовителя базы данных.

2.2. Постановление Правительства Российской Федерации от 29.10.2007 N 720* "О внесении изменений в пункт 5 Положения о лицензировании деятельности, связанной с использованием возбудителей инфекционных заболеваний ", утвержденного постановлением Правительства Российской Федерации от 22.01.2007 N 31* .
________________
* Документ утратил силу на основании постановления Правительства Российской Федерации от 16 апреля 2012 года N 317

2.3. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 24.02.2009 N 11 "О представлении внеочередных донесений о чрезвычайных ситуациях в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера" (зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 10.04.2009 N 13745).

2.4. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 7.07.2009 N 415н "Об утверждении квалификационных требований к специалистам с высшим и послевузовским медицинским и фармацевтическим образованием в сфере здравоохранения" (зарегистрирован в Минюсте Российской Федерации 09.07.2009 N 14292).

2.6. СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности" (утв. постановлением Госкомсанэпиднадзора Российской Федерации от 28.08.1995 N 14).

2.7. СП 3.1.7.2642-10 "Профилактика туляремии" (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31.05.2010 N 61 "Об утверждении СП 3.1.7.2642-10" . Зарегистрировано в Минюсте РФ 7.07.2010 N 7745).

2.8. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)" (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 15.04.2003 N 42 "О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.1285-03" . Зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 10.05.2003 N 4545).

2.9. СП 1.3.1318-03* "Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами" (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30.04.2003 N 85 "О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 1.2.1318-03" . Зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 19.05.2003 N 4558).
______________
* Вероятно ошибка оригинала. Следует читать: СП 1.2.1318-03 . - Примечание изготовителя базы данных.

2.12. СП 3.4.2318-08 "Санитарная охрана территории Российской Федерации" (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 22.01.2008 N 3 "Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 3.4.2318-08" . Зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 3.04.2008 N 11459).

2.13. СанПиН 2.1.7.2790-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами" (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 9.12.2010 N 163 . Зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 17.02.2011 N 19871).

2.14. СанПиН 2.1.3.2630-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность" (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 18.05.2010 N 58 . Зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 9.08.2010 N 18094).

2.15. Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) (утв. главным государственным санитарным врачом СССР от 6.04.73 N 1045-73).

2.16. МУ 3.1.2007-05 "Эпидемиологический надзор за туляремией".

2.17. МУ 3.3.2.2124-06 "Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии".

2.18. МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред".

2.19. МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности".

2.20. МУ 4.2.2495-09 "Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чумы, сибирской язвы, холеры, туляремии, бруцеллеза, сапа и мелиоидоза) к антибактериальным препаратам".

3. Перечень сокращений

ЛПС - липополисахарид

ЛПУ - лечебно-профилактическое учреждение

ООИ - особо опасные инфекции

СП - санитарно-эпидемиологические правила

СанПиН - санитарно-эпидемиологические правила и нормативы

МУ - методические указания

ПБА - патогенный биологический агент

МФА - метод флуоресцирующих антител

ИФА - иммуноферментный анализ

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - реакция агглютинации

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

РТНГА - реакции торможения непрямой гемагглютинации

РНАт - реакция нейтрализации антител

МИС - магноиммуносорбенты

РЛА - реакция латекс-агглютинации

ИХ - иммунохроматография

ИХ-тест - иммунохроматографический тест

4. Общие положения

Характеристика болезни и возбудителя туляремии

Туляремия - зоонозная системная природно-очаговая бактериальная инфекционная болезнь, характеризующаяся симптомами общей интоксикации, лихорадкой, воспалительными изменениями в области ворот инфекции, регионарным лимфаденитом, склонностью к затяжному течению.

Основными резервуарами и источниками возбудителя туляремии в естественных условиях являются дикие животные (около 50 видов), главным образом различные виды грызунов, и зайцы. На территории природных очагов туляремии могут заражаться овцы, свиньи, крупный рогатый скот. Резервуаром и переносчиками возбудителя являются также кровососущие членистоногие: иксодовые и гамазовые клещи, комары, слепни, блохи. Больной человек эпидемиологической опасности не представляет.

Как и для всех зоонозов, для туляремии характерна множественность механизмов (аспирационный, контактный, фекально-оральный, трансмиссивный), а также путей и факторов передачи. В соответствии с Международной статистической классификацией болезней и проблем, связанных со здоровьем (Десятый пересмотр. Женева, 2003, (МКБ-10), и по локализации основного патологического процесса различают следующие формы туляремии:

А21.0 - ульцерогландулярную (язвенно-бубонную);

А21.1 - окулогландулярную (глазо-бубонную);

А21.2 - легочную;

А21.3 - желудочно-кишечную (абдоминальную);

А21.7 - генерализованную;

А21.8 - другие формы туляремии (ангинозно-бубонную);

5.1.1. Требования к лабораториям лечебно-профилактических учреждений, осуществляющим исследования на туляремию

Лечебно-профилактические учреждения, лаборатории которых осуществляют диагностические исследования на туляремию, должны иметь лицензию на осуществление деятельности, связанной с использованием возбудителей III-IV групп патогенности (опасности).

Лаборатории ЛПУ должны иметь санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими СП о порядке выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами.

Учет, хранение, передача и транспортирование выделенных культур холерных вибрионов (подозрительных) должны осуществляться в соответствии с действующими нормативными документами о порядке учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности.



Проведение исследований на всех этапах - отбор проб, их хранение, доставка в лабораторию, регистрация, порядок исследования, выдача результатов, взаимодействие с учреждениями Роспотребнадзора - должно соответствовать требованиям действующих нормативных и распорядительных документов.



Исследования на туляремию могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим образованием, окончившие курсы подготовки по специальности "Бактериология" с освоением методов безопасной работы с возбудителями инфекционных болезней III-IV групп патогенности (опасности), имеющие допуск к работе с ПБА III-IV групп патогенности на основании приказа руководителя учреждения. Специалисты, проводящие диагностические исследования на туляремию, должны иметь необходимые профессиональные навыки в соответствии с номенклатурой проводимых исследований (прилож. 8).

Специалисты, осуществляющие деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных болезней, должны повышать квалификацию не реже одного раза в пять лет и иметь сертификат специалиста.









Контроль качества диагностических исследований на туляремию в лабораториях ЛПУ включает:












Правила ведения документации





Для забора материала и проведения диагностических исследований на туляремию в бактериологических лабораториях ЛПУ должны быть в наличии:





Персонал должен быть обеспечен спецодеждой и средствами индивидуальной защиты (для отбора проб клинического материала и проведения иммуносерологических реакций).

5.1.2. Номенклатура и объем исследований

В ЛПУ производят отбор клинического материала от лиц с подозрением на туляремию, больных различными формами туляремии и вакцинированных, а также секционного материала от умерших лиц.

В бактериологических лабораториях ЛПУ проводят исследования сывороток крови от больных туляремией и вакцинированных против туляремии лиц иммуносерологическими и аллергологическим методами:

1) выявление антител в парных сыворотках;

2) проведение реакции лизиса лейкоцитов.

Врач-инфекционист ЛПУ осуществляет оценку аллергологического статуса больных путем постановки аллергической пробы с тулярином.

5.1.3. Порядок лабораторной диагностики туляремии в лабораториях лечебно-профилактических учреждений

Отбор и транспортирование проб клинического материала

Материал от больных забирает медицинский персонал ЛПУ при поступлении больного, до начала лечения антибактериальными препаратами. Забор проб осуществляют два медицинских работника, один из которых врач-инфекционист или терапевт (хирург), подготовленный по вопросам диагностики особо опасных инфекций и соблюдения требований биологической безопасности при работе с клиническим материалом, подозрительным на содержание возбудителей инфекционных болезней I-II групп патогенности. Материал от вакцинированных лиц забирает медицинский персонал ЛПУ

Секционный материал забирают медицинские работники патолого-анатомических отделений (или БСМЭ) в присутствии специалиста по особо опасным инфекциям, руководствуясь действующими методическими указаниями по организации и проведению первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения, с соблюдением регламентированных требований биологической безопасности при работе с патогенными биологическими агентами I-II групп.

Для направления в бактериологические лаборатории учреждений Роспотребнадзора забирают:

от больных людей в зависимости от клинической формы болезни: содержимое бубона, материал из зева, с конъюнктивы глаза, отделяемое язвы, мокроту, кровь;

от умерших людей: увеличенные лимфатические узлы, измененные участки легких и селезенки, трахеи;

от вакцинированных людей: кровь.

Забор проб всех видов материала осуществляют в стерильную стеклянную или пластиковую посуду, соответствующую объему проб.

Пунктат из бубона берут до 14-20 суток болезни шприцем емкостью не менее 5 мл. Кожу на участке, намеченном для прокола, обрабатывают 70%-м спиртом, а затем смазывают 5%-м раствором йода и вновь протирают 70%-м спиртом. Иглу вводят с таким расчетом, чтобы ее острие достигло центральной части бубона, после чего, оттянув до отказа поршень, медленно вынимают иглу. Содержимое переносят в стерильную пробирку с завинчивающейся пробкой. Можно перед взятием материала ввести в бубон 0,3-0,5 мл стерильного 0,9%-го раствора натрия хлорида и затем отобрать содержимое. При вскрывшемся бубоне забирают материал отдельно из периферической плотной части и отделяемое свища.

Перед взятием отделяемого язвы, папулы, везикулы или отторгнутого струпа прединъекционной дезинфицирующей салфеткой осторожно очищают кожу вокруг пораженного места, при необходимости стерильной марлевой салфеткой удаляют некротические массы, гной. Прокатывая тампон по раневой поверхности от центра к периферии в течение 5-10 с абсорбируют материал на тампон. Тампон с материалом помещают в пробирку или транспортную среду. При использовании шприца иглу вводят у края везикулы (пустулы) и затем продвигают к середине. У язв пунктируют плотный край.

Мокроту собирают в специальные широкогорлые контейнеры с завинчивающейся крышкой.

Отделяемое слизистой зева забирают натощак или через 3-4 ч после еды. Аккуратно прижимая язык шпателем, вводят тампон между дужками миндалин и язычком (нельзя касаться тампоном губ, щек, языка) и собирают материал с задней поверхности глотки, миндалин и участков воспаления или изъязвления слизистой. Тампон с материалом помещают в стерильную пробирку или в пробирку с транспортной или питательной средой.

Кровь для исследований берут с соблюдением правил асептики и мер индивидуальной защиты. Кровь забирают из локтевой вены в количестве 10-20 мл одноразовым шприцем и переносят в пробирку для посева на питательные среды и заражения биопробных животных, в пробирку с антикоагулянтом (4%-й раствор натрия цитрата в отношении 1:10 к объему крови или 6%-й раствор ЭДТА в отношении 1:20 к объему крови) для ПЦР-анализа, в пробирку для получения сыворотки для иммуносерологических реакций.

Для постановки кровяно-капельной реакции агглютинации и реакции лейкоцитолиза кровь берут из пальца.

Отделяемое конъюнктивы глаза следует забирать до 17 суток болезни с помощью стерильного тампона, предварительно увлажненного 0,9%-м раствором натрия хлорида. Пробы из каждого глаза собирают отдельными тампонами двумя-тремя круговыми движениями по слизистой оболочке глаза. Тампон с материалом помещают в стерильную пробирку или транспортную среду. При наличии обильного гнойного отделяемого стерильным сухим ватным тампоном берут гной с внутренней поверхности нижнего века движением к внутреннему углу глазной щели. Необходимо следить, чтобы ресницы не касались тампона (придерживать веко рукой). Доставка материала в лабораторию в течение 1 ч, если используются специальные транспортные среды - в течение суток.

Емкости с пробами маркируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией и помещают в контейнер для транспортирования биологического материала на исследование. Контейнер с упакованным материалом опечатывают и отправляют в лабораторию с нарочным на специально выделенном транспорте. Поверхность стола после упаковки проб обрабатывают дезинфицирующим раствором.

На доставляемые в лабораторию пробы заполняют направление (прилож.1), в котором указывают: адрес учреждения, в которое направляется проба (пробы); фамилию, имя, отчество больного (умершего); пол, возраст, место жительства, дату заболевания, дату обращения за медицинской помощью, дату госпитализации, предварительный диагноз; особенности эпидемиологического анамнеза; проводилась ли больному до взятия материала антибактериальная терапия (когда, какие использовались препараты, в какой дозе); вид материала, взятого для бактериологического исследования; цель исследования; дату и час забора материала; адрес, по которому следует сообщить результаты бактериологического исследования; наименование учреждения, должность, фамилию и инициалы лица, направляющего пробу (пробы), подпись; время доставки пробы; должность, фамилию и инициалы принявшего пробы.

Материал транспортируют в лабораторию в сумке-холодильнике. В случае отсутствия условий для хранения материала на холоде время от момента взятия материала до начала исследования не должно превышать 5-6 ч.



Постановку и учет иммуносерологических реакций проводят в бактериологической лаборатории ЛПУ в соответствии с инструкциями по применению диагностических препаратов. В динамике заболевания исследуют парные сыворотки с интервалом 7-10 дней. Диагностически достоверным является 4-кратное и более увеличение титра антител.

Гиперчувствительность у больных и вакцинированных лиц определяют in vitro

Постановку и учет результатов аллергической пробы с тулярином (аллерген туляремийный жидкий, суспензия для накожного скарификационного нанесения) у лиц, зараженных или подозрительных на зараженность туляремией, осуществляет врач-инфекционист ЛПУ в соответствии с инструкцией по применению препарата.

Следует помнить, что аллергическая проба остается положительной у лиц, переболевших туляремией.

5.1.4. Оформление результатов исследования

Регистрацию результатов серологического и аллергического исследования сывороток на туляремию в бактериологических лабораториях ЛПУ осуществляют в соответствии с учетными формами, установленными в учреждении. Выдача ответов для историй болезней - по унифицированным формам.

5.1.5. Порядок взаимодействия лечебно-профилактических учреждений с организациями Роспотребнадзора

5.2. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании (городе и административных районах субъекта, объединенных по территориальному признаку) в субъекте Российской Федерации

5.2.1. Требования к лабораториям филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации, осуществляющим исследования на туляремию

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов

ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации, на базе филиалов которого функционируют бактериологические лаборатории, должен иметь лицензию на осуществление деятельности, связанной с использованием возбудителей II-IV (или III-IV) групп патогенности (опасности).

Лаборатории филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации, выполняющие исследования на туляремию, должны иметь санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими СП о порядке выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных болезней человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами.

Лаборатории филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации должны быть аккредитованы на техническую компетентность в установленном порядке в соответствии с действующей законодательной базой Российской Федерации.

Учет, хранение, передача и транспортирование проб клинического материала должны осуществляться в соответствии с действующими СП о порядке учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности.

Утилизация отходов должна осуществляться в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими требованиями к обращению с медицинскими отходами.



Требования к специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований на туляремию

Исследования на туляремию могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим образованием, окончившие курсы подготовки по специальности "Бактериология" с освоением методов безопасной работы с возбудителями инфекционных болезней III-IV групп патогенности (опасности), имеющие допуск к работе с ПБА III-IV групп на основании приказа руководителя учреждения. Специалисты, проводящие диагностические исследования на туляремию, должны иметь необходимые профессиональные навыки в соответствии с номенклатурой проводимых исследований (прилож.8).

Специалисты, осуществляющие деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных болезней, должны иметь сертификат специалиста и повышать квалификацию не реже одного раза в пять лет.

Требования к обеспечению безопасности работы персонала

Каждая лаборатория, выполняющая исследования на туляремию, должна иметь пакет документов, определяющих режим безопасной работы сотрудников с учетом характера работ, особенностей технологии, свойств микроорганизмов. Документы должны быть согласованы с комиссией по контролю соблюдения требований биологической безопасности, специалистами по охране труда, противопожарным мероприятиям и утверждены руководителем учреждения. Результаты проверок знаний правил техники безопасности персонала при проведении работ фиксируются в специальном журнале.

Все сотрудники должны выполнять требования по обеспечению безопасности работы с материалом, подозрительным или зараженным возбудителями инфекционных болезней III-IV групп патогенности (опасности), в соответствии с действующими нормативными документами.

Сотрудники учреждения, привлекаемые к эпизоотологическому обследованию энзоотичной территории, должны быть вакцинированы против туляремии с последующим контролем уровня иммунитета и регистрацией результатов в специальном журнале.

Порядок организации внутреннего контроля качества лабораторных исследований

Контроль качества диагностических исследований на туляремию в лабораториях включает:

контроль качества диагностических препаратов и тест-систем, дистиллированной воды, химических реактивов и дезинфицирующих средств;

своевременную поверку средств измерений, аттестацию испытательного оборудования;

контроль качества стерилизации лабораторной посуды;

контроль работы паровых и суховоздушных стерилизаторов;

контроль работы бактерицидных ламп;

контроль температурного режима холодильников;

контроль температурного режима термостатов;

проверку состояния воздуха производственных помещений и боксов, температурного режима, влажности;

проверку санитарного состояния помещений, включая условия уборки, дезинфекции, контроль смывов с поверхностей и оборудования.

Результаты контроля фиксируют в специальных журналах.

Правила ведения документации

Ведение лабораторной документации, включая регистрационные и рабочие журналы, осуществляют в соответствии с требованиями действующих нормативно-методических документов.

Требования к материальным ресурсам, необходимым для выполнения диагностических исследований на туляремию

Для проведения диагностических исследований на туляремию в бактериологических лабораториях филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" должны быть в наличии:

диагностические препараты, тест-системы, зарегистрированные в установленном порядке (прилож.3);

химические реактивы (прилож.4);

приборы, оборудование, расходные материалы (прилож.5, 6).

Рекомендуется для забора материала иметь комплект медицинский (укладку универсальную для забора материала от людей и из объектов окружающей среды для исследования на особо опасные инфекционные болезни).

Персонал должен быть обеспечен спецодеждой и средствами индивидуальной защиты.

5.2.2. Номенклатура и объем исследований

Лаборатории филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальных образованиях в субъекте Российской Федерации при осуществлении эпидемиологического надзора проводят контроль состояния противотуляремийного иммунитета у вакцинированных людей.

Исследования осуществляют в следующем объеме:

1) выявление антител;

2) постановка реакции лизиса лейкоцитов.

Если лаборатория ЛПУ не выполняет серологические исследования на туляремию, сыворотку больных или с подозрением на это заболевание исследуют в филиале ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации (по договоренности).

5.2.3. Порядок лабораторной диагностики туляремии в лабораториях филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации

Состояние иммунитета у вакцинированных проверяют через 5 лет после вакцинации и в последующем - 1 раз в 2 года.

Контроль состояния противотуляремийного иммунитета осуществляют с помощью аллергологического (реакция лейкоцитолиза) или одного из серологических методов исследования (РА, реакция объемной агломерации, РНГА, ИФА). При этом предпочтительнее использовать серологические методы исследования. Материалом для исследования являются кровь и сыворотка крови вакцинированного. При необходимости можно использовать кровяно-капельную реакцию, которая позволяет выдать ответ в течение 5 мин и может быть поставлена с сухой каплей крови.

От больных или лиц с подозрением на туляремию в динамике заболевания исследуют парные сыворотки с интервалом 7-10 дней. Диагностически достоверным является 4-кратное и более увеличение титра антител.

Гиперчувствительность у вакцинированных и больных лиц определяют in vitro в реакции лейкоцитолиза в соответствии с действующими методическими указаниями по эпидемиологическому надзору за туляремией.

5.2.4. Оформление результатов исследования

Регистрацию результатов исследований в лабораториях филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации осуществляют в соответствии с учетными формами, установленными в учреждении. Выдача ответов - по унифицированным формам.

5.2.5. Порядок взаимодействия филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации с другими организациями Роспотребнадзора

Информация о результатах лабораторной диагностики туляремии в лаборатории филиала ФБУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в субъекте Российской Федерации передаётся в соответствии с действующими нормативными документами.

5.3. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации

5.3.1. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации, в структуре которых отсутствуют отделы и лаборатории особо опасных инфекций

Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации, в структуре которых отсутствуют отделы или лаборатории особо опасных инфекций, соответствует порядку организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации (раздел 5.2).

5.3.2. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий особо опасных инфекций ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации

5.3.2.1. Требования к лабораториям особо опасных инфекций ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации, осуществляющим исследования на туляремию.

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов

ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации, на базе которых функционируют лаборатории особо опасных инфекций, выполняющие исследования на туляремию, должны иметь лицензию на осуществление деятельности, связанной с использованием возбудителей II-IV групп патогенности (опасности).

Лаборатории ООИ ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации, осуществляющие исследования на туляремию, должны иметь санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с микроорганизмами II-IV групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими СП о порядке выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных болезней человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами.

Лаборатории ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации должны быть аккредитованы на техническую компетентность в установленном порядке в соответствии с действующей законодательной базой Российской Федерации.

Учет, хранение, передача и транспортирование выделенных подозрительных культур возбудителя туляремии и/или проб клинического материала должны осуществляться в соответствии с действующими СП о порядке учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности.

Утилизация отходов должна осуществляться в соответствии с регламентированными санитарно-эпидемиологическими требованиями к обращению с медицинскими отходами.

Проведение исследований на всех этапах: отбор проб, их хранение, доставка в лабораторию, регистрация, порядок исследования, выдача результатов, взаимодействие с организациями Роспотребнадзора должны соответствовать требованиям действующих нормативных документов.

Требования к специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований на туляремию

Исследования на туляремию могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим образованием, окончившие курсы подготовки по специальности "Бактериология" с основами безопасной работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) I-II групп, имеющие допуск к работе с ПБА II-IV групп на основании приказа руководителя учреждения. Специалисты, проводящие исследования на туляремию, должны иметь необходимые профессиональные навыки (прилож.8).

Специалисты, осуществляющие деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных болезней, должны иметь сертификаты и повышать квалификацию не реже одного раза в пять лет.

Требования к обеспечению безопасности работы персонала

Каждая лаборатория, осуществляющая исследования на туляремию, должна иметь пакет документов, определяющих режим безопасной работы сотрудников с учетом характера работ, особенностей технологии, свойств микроорганизмов. Документы должны быть согласованы с комиссией по контролю соблюдения требований биологической безопасности, специалистами по охране труда, противопожарным мероприятиям и утверждены руководителем учреждения. Результаты проверок знаний правил техники безопасности персонала при проведении работ фиксируются в специальном журнале.

Специалисты, осуществляющие эпизоотологическое обследование энзоотичной по туляремии территории и его лабораторное обеспечение, должны быть вакцинированы против туляремии с последующим контролем уровня иммунитета и регистрацией результатов в специальном журнале.

Все сотрудники должны выполнять требования по обеспечению безопасности работы с материалом, подозрительным или зараженным возбудителями инфекционных болезней I-II групп патогенности (опасности), в соответствии с действующими нормативными документами.

Порядок организации внутреннего контроля качества лабораторных исследований

Контроль качества диагностических исследований на туляремию в лабораториях ООИ ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" включает:

контроль качества питательных сред, диагностических препаратов и тест-систем, дисков с антибактериальными препаратами, дистиллированной воды, химических реактивов и дезинфицирующих средств;

своевременную поверку средств измерений, аттестацию испытательного оборудования;

контроль качества стерилизации лабораторной посуды;

контроль работы паровых и суховоздушных стерилизаторов;

контроль работы бактерицидных ламп;

контроль температурного режима холодильников;

контроль температурного режима термостатов;

проверку состояния воздуха производственных помещений и боксов, температурного режима, влажности;

проверку санитарного состояния помещений, включая условия уборки, дезинфекции, контроль смывов с поверхностей и оборудования.

Результаты контроля фиксируют в специальных журналах.

Правила ведения документации

Ведение лабораторной документации, включая регистрационные и рабочие журналы, осуществляют ежедневно в соответствии с требованиями действующих методических документов.

Требования к материальным ресурсам, необходимым для выполнения диагностических исследований на туляремию

Для проведения диагностических исследований на туляремию в лабораториях должны быть в наличии:

питательные среды, зарегистрированные в установленном порядке (прилож.2);

диагностические препараты, тест-системы, антибактериальные препараты, зарегистрированные в установленном порядке (прилож.3, 7);

химические реактивы (прилож.4);

приборы, оборудование, расходные материалы (прилож.5, 6);

комплект медицинский (укладка универсальная для забора материала от людей и из объектов окружающей среды для исследования на особо опасные инфекционные болезни).

Питательные среды подлежат обязательному контролю согласно действующим методическим указаниям по контролю диагностических питательных сред по биологическим показателям (для возбудителя туляремии).

5.3.2.2. Номенклатура и объем исследований.

Лаборатории ООИ ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации, проводят:

исследование материала от больных и умерших с подозрением на туляремию;

исследование материала от лиц, подлежащих обследованию на туляремию в соответствии с требованиями эпиднадзора (по согласованию);

исследование проб, собранных в ходе эпизоотологического обследования территории;

исследование проб из объектов окружающей среды;

идентификацию выделенных культур возбудителя туляремии по сокращенной схеме;

контроль качества и ингибирующих свойств питательных сред.

Диагностические исследования материала осуществляют в следующем объеме:

а) индикация возбудителя в нативном материале методами экспресс- и ускоренной диагностики (МФА, ПЦР, ИФА, РА, РНГА, РНАт, селективное концентрирование на МИС с последующей постановкой ИФА);

б) постановка биологической пробы;

в) посев на питательные среды с целью выделения чистой культуры возбудителя;

г) выявление антител к возбудителю туляремии;

д) идентификация выделенной культуры по сокращенной схеме.

5.3.2.3. Порядок диагностических исследований на туляремию в лабораториях особо опасных инфекций ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации.

Порядок исследования клинического материала

Отбор материала осуществляют в соответствии с п.5.1.

Для выявления возбудителя туляремии используют диагностические препараты и сложные агаровые или желточные среды с добавлением цистеина, тканевых экстрактов, дефибринированной крови, глюкозы, зарегистрированные в установленном порядке. Каждая серия агара должна быть проверена на чувствительность к росту туляремийного микроба согласно действующим нормативно-методическим документам. Для подавления роста посторонней микрофлоры используют пенициллин (100 ед./мл), ампициллин (100 ед./мл), полимиксин В (50-100 мкг/мл), кефзол (или цефалексин), амфотерицин В (или амфоглюкамин), ристомицина сульфат и некоторые другие антибактериальные препараты.

Объекты с посевами инкубируют при температуре 37 °С. Просмотр посевов осуществляют через 24-48 ч (далее - ежедневно в течение 10 суток от момента посева).

Подготовку проб для ПЦР осуществляют в соответствии с требованиями методических указаний по организации работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности.

Исследование материала от больного человека (трупа)

I этап:

приготовление мазков, окраска фиксированных мазков по Грамму, Романовскому-Гимзе, иммуноглобулинами флюоресцирующими туляремийными;

постановка ПЦР;

постановка иммуносерологических реакций для обнаружения антигенов и антител к возбудителю туляремии (РА, МФА, РНГА, РНАт, ИФА и др.);

постановка реакции лейкоцитолиза (кровь больного);

заражение биопробных животных (морские свинки внутрибрюшинно; белые мыши внутрибрюшинно или подкожно (кровь, пунктат бубона), подкожно (мокрота, мазок из зева, вскрывшийся бубон, отделяемое язвы, конъюнктивы);

посев на плотные питательные среды (кровь, пунктат бубона);

посев на плотные питательные среды с ингибиторами посторонней флоры (мокрота, мазок из зева, субстрат из вскрывшегося бубона, отделяемое язвы, конъюнктивы).

II этап (2-6 ч от начала исследования):

учет результатов МФА, ИФА, ПЦР;

учет результатов РА, РПГА и РНАт через 18-24 ч;

выдача предварительного положительного ответа на основании наличия в мазках мелких кокковидных палочек грамотрицательных или сиреневого цвета при окраске по Романовскому-Гимзе, их специфического свечения при окраске мазка иммуноглобулинами флуоресцирующими туляремийными, положительного результата ПЦР, положительных иммуносерологических реакций при отрицательных контролях.

III этап (48-72 ч от начала исследования):

просмотр посевов нативного материала на агаровых пластинках;

бактериоскопия мазков из подозрительных колоний (окраска по Граму);

постановка ИХ-теста для экспресс-идентификации туляремийного микроба с материалом из подозрительных колоний;

отсев подозрительных колоний туляремийного микроба на питательный агар для выделения чистой культуры;

выдача подтверждения предварительного положительного ответа на основании наличия характерного роста на плотных питательных средах, наличия в мазках из колоний мелких грамотрицательных кокковидных палочек, положительного ИХ-теста для экспресс-идентификации туляремийного микроба.

IV этап (3-5-е сутки от начала исследования):

после накопления чистой культуры постановка тестов для ее идентификации. Идентификацию выделенной культуры проводят по следующим тестам:

морфология клетки, характер окраски по Граму и иммуноглобулинами флуоресцирующими туляремийными;

характер роста на питательных средах FT-arape или на свернутой желточной среде Мак-Коя;

отсутствие роста на простых питательных средах (мясопептонном агаре и/или бульоне);

агглютинация культур специфической туляремийной сывороткой или постановка РЛА с выделенной культурой;

экспресс-идентификация туляремийного микроба с использованием ИХ-теста;

выявление видоспецифичных ДНК-мишеней методом ПЦР;

вскрытие павших биопробных животных, посев органов и крови на плотные питательные среды, приготовление и просмотр мазков-отпечатков органов, постановка ПЦР с суспензиями органов.

V этап (5-15-е сутки от начала исследования):

учет результатов идентификации культур;

просмотр посевов материала от павших биопробных животных;

вскрытие и исследование забитых биопробных животных;

выдача окончательного положительного ответа проводится на основании выделения чистой культуры туляремийного микроба из посевов нативного материала, его идентификации по морфологическим, культуральным свойствам, положительных результатов иммуносерологических реакций, наличию ДНК возбудителя, а также на основании выделения идентичных культур от павших или забитых лабораторных животных.

Вторая группа . Высоковосприимчивые, но малочувствительные млекопитающие (заражаются при попадании в организм единичных микробных клеток возбудителя туляремии, болеют тяжело, но быстро освобождаются от микроба, приобретая устойчивый иммунитет). К этой группе относятся полевая мышь, все виды крыс и сусликов, белки, бурундуки, бобры, ежи, выхухоль, кутора, белозубка и некоторые другие виды млекопитающих.

Третья группа . Маловосприимчивые и практически нечувствительные млекопитающие. К ним относится большинство хищных млекопитающих и сельскохозяйственных животных.

Схема исследования полевого материала

Лабораторное исследование полевого материала начинают сразу же после его поступления. Допускается его кратковременное хранение (не более 20 ч) при температуре от 4 до 6 °С. При вскрытии зверьков на месте сбора возможно хранение органов и доставка их в лабораторию в консерванте. Консервантами могут служить вазелино-парафиновая смесь (1 часть парафина и 10 частей вазелинового масла смешивают и стерилизуют 45 мин прогреванием на кипящей водяной бане), 5%-й раствор поваренной соли, кроме того, используют глубокое замораживание в жидком азоте и др. В консервантах и при низкой температуре органы животных можно сохранять в течение одного месяца.

Исследование проводят биологическим, бактериоскопическими (световая и люминесцентная микроскопия), бактериологическими (посев на питательные среды, выделение чистых культур и их идентификация), молекулярно-генетическим (ПЦР-анализ) и иммуносерологическими (РА, РЛА, РНГА, РНАт, РНАг, ИФА) методами. Схема исследования материала зависит от группы чувствительности животных и от того, в каком виде доставлен материал.

Мелких млекопитающих , добытых в природе орудиями лова или живыми, исследуют групповым методом, объединяя в одну пробу органы нескольких зверьков (5-10) одного вида и пойманных в одном месте.

Для исследования отбирают кусочки селезенки, печени, лимфатические узлы, кровь или "смывы" из грудной полости. Материал исследуют биологическим, молекулярно-генетическим и иммуносерологическими методами.

Суспензию органов используют для заражения биопробных животных и выявления антигенов и ДНК возбудителя туляремии. Сыворотку крови или "смывы" из грудной полости исследуют на наличие антител к возбудителю туляремии.

Трупы зверьков , погибших в природе, павших в лаборатории, или животных, у которых при вскрытии обнаружены патолого-анатомические изменения, характерные для туляремии, подвергают индивидуальному исследованию. Кусочки селезенки, печени, почек, лимфатические узлы, костный мозг исследуют биологическим, бактериологическим, молекулярно-генетическим и иммуносерологическими методами.

В условиях установленной эпизоотии при исследовании животных первой группы можно ограничиться посевом органов на питательные среды и бактериоскопией мазков из органов, сохраняя часть их на холоде до получения результатов исследований. В сомнительных случаях прибегают к биологическому методу. Животных второй и третьей групп биологическим методом исследуют обязательно.

Вероятность обнаружения возбудителя туляремии в органах животных первой группы при микроскопическом исследовании (лучше использовать люминесцентную микроскопию) значительно выше, чем при бактериоскопии мазков из органов трупов животных второй группы.

Домашние животные (крупный рогатый скот, свиньи, овцы, северные олени) относятся к видам, малочувствительным к туляремии (третья группа). При их исследовании используют главным образом иммуносерологические методы (РА, РНГА, ИФА), реже - внутрикожную пробу с тулярином. Бактериологический и биологический методы применяют только при обследовании павших, забитых или больных животных. Исследуют в первую очередь лимфатические узлы и селезенку. При серологическом исследовании следует учитывать возможность обнаружения перекрестных реакций с бруцеллами и микробной флорой кишечника животных. Целесообразно исследовать сыворотки домашних животных, по крайней мере, в двух серологических реакциях. Положительные реакции в РНГА следует контролировать в РТНГА.

Погадки хищных птиц и помет хищных млекопитающих рекомендуется исследовать индивидуально. Гибель туляремийного микроба в погадках и помете происходит быстро (в первые сутки; при отрицательных температурах, возможно, медленнее), в связи с чем биологическое и бактериологические исследования этого материала нецелесообразны. Пробы погадок и помета используют для поиска антигена возбудителя туляремии иммуносерологическими методами и ДНК методом ПЦР.

Кровососущих насекомых и других беспозвоночных животных исследуют групповым методом, в одну пробу объединяют насекомых или беспозвоночных животных одного вида (рода) и добытых из одного места.

Взрослых иксодовых клещей объединяют до 50 особей.

Личинок объединяют по 100-200 экземпляров, нимф - по 50-100 в зависимости от степени их упитанности. Промывание личинок и нимф иксодовых клещей в спирте не проводят, т.к. это может повредить анализу.

Блох, гамазовых клещей, вшей сортируют по видам (родам), а также по видам зверьков, с которых они были собраны, помещают в стерильные пробирки и далее подвергают обработке по той же методике, что личинок и нимф иксодовых клещей.

Кровососущих двукрылых насекомых усыпляют парами эфира для ограничения подвижности. У слепней предварительно отстригают конечности и крылья, комаров и мошек исследуют целиком. В один анализ включают до 25-50 слепней или до 100 комаров, или до 250 мошек.

Гидробионтов - ручейников, бокоплавов, дафний, циклопов и других перед исследованием промывают в нескольких порциях воды и 1-2 порциях стерильной дистиллированной воды. У животных, имеющих чехлики или раковинки, последние по возможности удаляют. Животных объединяют в группы по 5-10-50 экземпляров в зависимости от размеров особей отдельных видов.

Обнаружение туляремийного микроба или его ДНК в организме беспозвоночных наиболее эффективно при использовании биологического метода и ПЦР. Также возможно обнаружение специфического антигена туляремийного ЛПС с помощью ИХ-теста.

Пробы воды (100-200 мл) берут из различных водоемов: речек, ручьев, прудов, озер, болот, колодцев и т.п. Наиболее эффективно исследование воды в поименно-болотных очагах туляремии в зимнее время. Пробы берутся в затененном месте, на глубине 10-20 см от поверхности стоячей или слабопроточной воды. Из каждой точки следует брать по 2 пробы. Отбирают пробы в местах обитания зверьков (возле кормовых столиков, нор, хаток бобров или ондатр). Для концентрирования возбудителя используют фильтрование, центрифугирование, магнитные сорбенты и другие приемы. Для исследования используют биологический метод (белой мыши вводят подкожно до 1 мл, а морской свинке - до 5 мл воды), молекулярно-генетический и иммуносерологические методы, направленные на выявление ДНК и антигенов возбудителя туляремии.

Произошла ошибка

Платеж не был завершен из-за технической ошибки, денежные средства с вашего счета
списаны не были. Попробуйте подождать несколько минут и повторить платеж еще раз.