Métodos de pesquisa virológica. Diretrizes para o estudo do material teórico no curso "Virologia médica privada" Qual é o diagnóstico

Métodos de pesquisa virológica

métodos para estudar a biologia dos vírus e sua identificação. Na virologia, os métodos de biologia molecular são amplamente utilizados, com a ajuda dos quais foi possível estabelecer a estrutura molecular das partículas virais, como elas penetram na célula e as características da reprodução dos vírus, a estrutura primária dos ácidos nucleicos virais e proteínas. Métodos para determinar a sequência de elementos constituintes de ácidos nucleicos virais e aminoácidos de proteínas estão sendo desenvolvidos. Torna-se possível vincular as funções dos ácidos nucléicos e das proteínas codificadas por eles com a sequência nucleotídica e estabelecer as causas dos processos intracelulares que desempenham um papel importante na patogênese de uma infecção viral.

Os métodos de pesquisa virológica também são baseados em processos imunológicos (interação do antígeno com anticorpos), propriedades biológicas do vírus (capacidade de hemaglutinar, hemólise, atividade enzimática), características da interação do vírus com a célula hospedeira (a natureza da efeito, a formação de inclusões intracelulares, etc.).

No diagnóstico de infecções virais, no cultivo, isolamento e identificação de vírus, bem como na preparação de preparações vacinais, o método de cultura de tecidos e células é amplamente utilizado. São utilizadas culturas de células primárias, secundárias, contínuas estáveis e diplóides. As culturas primárias são obtidas pela dispersão do tecido com enzimas proteolíticas (tripsina, colagenase). A fonte de células pode ser tecidos e órgãos (mais frequentemente rins) de embriões humanos e animais. Uma suspensão de células em meio nutriente é colocada nos chamados colchões, garrafas ou placas de Petri, onde, após a fixação na superfície do vaso, as células começam a se multiplicar. Para infecção por vírus, geralmente é usada uma monocamada de células. O líquido nutriente é drenado, a suspensão viral é introduzida em certas diluições e, após contato com as células, adiciona-se meio nutriente fresco, geralmente sem soro.

As células da maioria das culturas primárias podem ser subcultivadas e são chamadas de culturas secundárias. Com a passagem adicional de células, forma-se uma população de células semelhantes a fibroblastos, capazes de reprodução rápida, a maioria das quais retém o conjunto original de cromossomos. Estas são as chamadas células diplóides. No cultivo em série de células, são obtidas culturas de células contínuas estáveis. Durante as passagens, aparecem células homogêneas que se dividem rapidamente com um conjunto heteroplóide de cromossomos. As linhas celulares estáveis podem ser monocamada e suspensão. As culturas em monocamada crescem na forma de uma camada contínua na superfície do vidro, as culturas em suspensão crescem na forma de suspensões em vários recipientes usando agitadores. Existem mais de 400 linhagens celulares derivadas de 40 espécies animais diferentes (incluindo primatas, pássaros, répteis, anfíbios, peixes, insetos) e humanos.

Pedaços de órgãos e tecidos individuais (culturas de órgãos) podem ser cultivados em meios nutrientes artificiais. Esses tipos de culturas preservam a estrutura do tecido, o que é especialmente importante para o isolamento e passagem de vírus que não se reproduzem em culturas de tecidos indiferenciados (por exemplo, coronavírus).

Em culturas de células infectadas, os vírus podem ser detectados por uma alteração na morfologia celular, ação citopática, que pode ser específica, pelo aparecimento de inclusões, pela determinação de antígenos virais na célula e no fluido de cultura; determinação das propriedades biológicas da progênie viral em fluido de cultura e titulação de vírus em cultura de tecidos, embriões de galinha ou animais sensíveis; detectando ácidos nucleicos virais individuais em células por hibridização molecular ou aglomerados de ácidos nucleicos por método citoquímico usando microscopia fluorescente.

O isolamento de vírus é um processo trabalhoso e demorado. É realizado para determinar o tipo ou variante do vírus que circula na população (por exemplo, para identificar a sorovariante do vírus influenza, cepa selvagem ou vacinal do vírus da poliomielite, etc.); nos casos em que seja necessário realizar medidas epidemiológicas urgentes; quando surgem novos tipos ou variantes de vírus; se necessário, confirmar o diagnóstico preliminar; para indicação de vírus em objetos ambientais. Ao isolar vírus, leva-se em consideração a possibilidade de sua persistência no corpo humano, bem como a ocorrência de uma infecção mista causada por dois ou mais vírus. Uma população geneticamente homogênea de um vírus obtido a partir de um único virion é chamada de clone viral, e o processo de obtenção é chamado de clonagem.

Para isolar vírus, infecção de animais de laboratório suscetíveis, embriões de galinha são usados, mas a cultura de tecidos é mais usada. A presença de um vírus é geralmente determinada pela degeneração celular específica (efeito citopático), a formação de simplastos e sincícios, a detecção de inclusões intracelulares, bem como um antígeno específico detectado por imunofluorescência, hemadsorção, hemaglutinação (em vírus hemaglutinantes), etc. . Esses sinais podem ser detectados somente após 2-3 passagens do vírus.

Para o isolamento de vários vírus, como vírus influenza, são usados embriões de galinha, para o isolamento de alguns vírus Coxsackie e vários arbovírus, são usados camundongos recém-nascidos. A identificação de vírus isolados é realizada usando testes sorológicos e outros métodos.

Ao trabalhar com vírus, seu título é determinado. A titulação de vírus geralmente é realizada em cultura de tecidos, determinando a maior diluição do fluido contendo vírus, na qual ocorre a degeneração do tecido, as inclusões e os antígenos específicos do vírus são formados. O método da placa pode ser usado para titular vários vírus. Placas, ou colônias negativas de vírus, são focos de células destruídas por vírus de uma cultura de tecido de camada única sob revestimento de ágar. A contagem de colônias permite uma análise quantitativa da atividade infecciosa dos vírus com base no fato de que uma partícula viral infecciosa forma uma placa. As placas são identificadas pela coloração da cultura com corantes vitais, geralmente vermelho neutro; as placas não absorvem o corante e, portanto, são visíveis como pontos de luz contra o fundo das células vivas coradas. O título do vírus é expresso como o número de unidades formadoras de placa em 1 ml.

A purificação e concentração de vírus são geralmente realizadas por ultracentrifugação diferencial seguida de centrifugação em gradientes de concentração ou densidade. Para purificar vírus, são usados métodos imunológicos, cromatografia de troca iônica, imunossorventes, etc.

O diagnóstico laboratorial de infecções virais inclui a detecção do patógeno ou de seus componentes em material clínico; isolamento do vírus deste material; sorodiagnóstico. A escolha do método de diagnóstico laboratorial em cada caso individual depende da natureza da doença, do período da doença e das capacidades do laboratório. O diagnóstico moderno de infecções virais baseia-se em métodos expressos que permitem obter uma resposta poucas horas após a coleta de material clínico nos estágios iniciais da doença, como a microscopia eletrônica e imunoeletrônica, a imunofluorescência, o método de hibridização molecular, a detecção de anticorpos da classe lgM, etc.

A microscopia eletrônica de vírus corados negativamente permite a diferenciação dos vírus e a determinação de sua concentração. O uso da microscopia eletrônica no diagnóstico de infecções virais é limitado àqueles casos em que a concentração de partículas virais no material clínico é suficientemente alta (10 5 em 1 ml e mais alto). A desvantagem do método é a incapacidade de distinguir entre vírus pertencentes ao mesmo grupo taxonômico. Esta desvantagem é eliminada usando microscopia eletrônica imune. O método baseia-se na formação de imunocomplexos quando se adiciona soro específico às partículas virais, enquanto ocorre a concentração simultânea das partículas virais, o que permite identificá-las. O método também é usado para detectar anticorpos. Para fins de diagnóstico expresso, é realizado um exame microscópico eletrônico de extratos de tecidos, fezes, fluido de vesículas e segredos da nasofaringe. A microscopia eletrônica é amplamente utilizada para estudar a morfogênese do vírus; suas capacidades são ampliadas com o uso de anticorpos marcados.

O método de hibridização molecular, baseado na detecção de ácidos nucleicos específicos de vírus, permite detectar cópias únicas de genes e não tem igual em termos de sensibilidade. A reação é baseada na hibridização de fitas complementares de DNA ou RNA (sondas) e na formação de estruturas de fita dupla. A sonda mais barata é o DNA recombinante clonado. A sonda é marcada com precursores radioativos (geralmente fósforo radioativo). O uso de reações colorimétricas é promissor. Existem várias variantes de hibridização molecular: hibridização pontual, hibridização blot, hibridização sanduíche, hibridização in situ, etc.

Os anticorpos da classe lgM aparecem mais cedo do que os anticorpos da classe G (no 3-5º dia da doença) e desaparecem após algumas semanas, de modo que sua detecção indica uma infecção recente. Os anticorpos da classe IgM são detectados por imunofluorescência ou imunoensaio enzimático usando anti-soros anti-μ (soros anti-IgM de cadeia pesada).

Os métodos sorológicos em virologia são baseados em reações imunológicas clássicas (consulte Métodos imunológicos de pesquisa) : reações de fixação do complemento, inibição da hemaglutinação, neutralização biológica, imunodifusão, hemaglutinação indireta, hemólise radial, imunofluorescência, imunoensaio enzimático, radioimunoensaio. Micrométodos para muitas reações foram desenvolvidos e suas técnicas estão sendo continuamente aprimoradas. Esses métodos são usados para identificar vírus usando um conjunto de soros conhecidos e para sorodiagnóstico para determinar o aumento de anticorpos no segundo soro em comparação com o primeiro (o primeiro soro é coletado nos primeiros dias após a doença, o segundo - após 2-3 semanas). O valor diagnóstico não é inferior a um aumento de quatro vezes nos anticorpos no segundo soro. Se a detecção de anticorpos da classe lgM indicar uma infecção recente, os anticorpos da classe lgC persistem por vários anos e, às vezes, por toda a vida.

Para identificar antígenos individuais de vírus e anticorpos para eles em misturas complexas sem purificação prévia de proteínas, é usado o immunoblotting. O método combina o fracionamento de proteínas usando eletroforese em gel de poliacrilamida com subsequente imunoensaio de proteínas por imunoensaio enzimático. A separação de proteínas reduz os requisitos para a pureza química do antígeno e torna possível identificar pares individuais de antígeno-anticorpo. Essa tarefa é relevante, por exemplo, no sorodiagnóstico da infecção pelo HIV, onde as reações de imunoensaio enzimático falso-positivo são devidas à presença de anticorpos contra antígenos celulares, que estão presentes como resultado da purificação insuficiente das proteínas virais. A identificação de anticorpos no soro de pacientes para antígenos virais internos e externos permite determinar o estágio da doença e na análise de populações - a variabilidade das proteínas virais. O imunoblotting na infecção pelo HIV é usado como um teste de confirmação para detectar antígenos virais individuais e anticorpos para eles. Ao analisar populações, o método é usado para determinar a variabilidade das proteínas virais. O grande valor do método está na possibilidade de analisar antígenos sintetizados por tecnologia de DNA recombinante, estabelecendo seu tamanho e a presença de determinantes antigênicos.

A pesquisa virológica inclui duas etapas principais: isolamento de vírus e sua identificação. O material para pesquisa virológica pode ser sangue, outros fluidos biológicos e patológicos, biópsias de órgãos e tecidos.

O teste de sangue virológico é frequentemente realizado para diagnosticar infecções por arbovírus. Na saliva podem ser detectados vírus da raiva, caxumba, herpes simplex, swabs nasofaríngeos servem para isolar influenza e outros patógenos ARVI, sarampo. Nas lavagens da conjuntiva, são encontrados adenovírus. Vários entero-, adsno-, pso-, nora- e rotavírus são isolados das fezes.

Culturas de células, embriões de galinha e, às vezes, animais de laboratório são usados para isolar vírus.

A maioria dos vírus patogênicos são específicos do tecido e do tipo, por exemplo, o poliovírus se reproduz apenas em células de primatas, portanto, uma cultura de tecido apropriada é usada para isolar um vírus específico. Para isolar um patógeno desconhecido, é aconselhável infectar simultaneamente 3-4 culturas de células, assumindo que uma delas pode ser sensível. A presença do vírus em culturas de células infectadas é determinada pelo desenvolvimento de degeneração celular específica, i.e. efeito citopatogênico, detecção de inclusões intracelulares, bem como com base na detecção de um antígeno específico por imunofluorescência, hemadsorção positiva e reações de hemaglutinação.

Embriões de aves com seus tecidos pouco diferenciados são adequados para o cultivo de muitos vírus. Bate-papo é só usar embriões de galinha. Ao se multiplicar em embriões, os vírus podem causar sua morte (arbovírus), o aparecimento de alterações na membrana cório-alantóica (vírus da varíola) ou no corpo do embrião, o acúmulo de glutinina mag em fluidos embrionários em fluidos embrionários (vírus influenza , caxumba) e o complemento do antígeno viral de ligação.

A identificação dos vírus é realizada por métodos imunológicos: reação de inibição da hemaglutinação, fixação do complemento, neutralização, precipitação em gel, imunofluorescência.

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Métodos de pesquisa virológica

Em culturas de células infectadas, pode ser detectada por alteração na morfologia celular, ação citopática, que pode ter caráter específico, aparecimento de inclusões, pela determinação de antígenos virais na célula e no fluido de cultura; determinação das propriedades biológicas da progênie viral em fluido de cultura e titulação de vírus em cultura de tecidos, embriões de galinha ou animais sensíveis; detectando ácidos nucleicos virais individuais em células por hibridização molecular ou aglomerados de ácidos nucleicos por método citoquímico usando microscopia fluorescente.

Para isolar vírus, animais de laboratório suscetíveis, são usados embriões de galinha, mas a cultura de tecidos é mais usada. A presença de um vírus é geralmente determinada pela degeneração celular específica (efeito citopático), a formação de simplastos e sincícios, a detecção de inclusões intracelulares, bem como um antígeno específico detectado por imunofluorescência, hemadsorção, hemaglutinação (em vírus hemaglutinantes), etc. . Esses sinais podem ser detectados somente após 2-3 passagens do vírus.

Ao trabalhar com vírus, seu título é determinado. A titulação de vírus geralmente é realizada em cultura de tecidos, determinando a maior diluição do fluido contendo vírus, no qual os tecidos ocorrem, e os vírus específicos são formados. O método da placa pode ser usado para titular vários vírus. Placas, ou colônias negativas de vírus, são focos de células destruídas por vírus de uma cultura de tecido de camada única sob revestimento de ágar. A contagem de colônias permite quantificar a atividade infecciosa dos vírus com base no fato de que uma partícula viral infecciosa forma uma placa. As placas são identificadas pela coloração da cultura com corantes vitais, geralmente vermelho neutro; as placas não absorvem o corante e, portanto, são visíveis como pontos de luz contra o fundo das células vivas coradas. expresso como o número de unidades formadoras de placa em 1 ml.

O diagnóstico laboratorial de infecções virais inclui a detecção do patógeno ou de seus componentes em material clínico; vírus deste material; sorodiagnóstico. A escolha do método de diagnóstico laboratorial em cada caso individual depende da natureza da doença, do período da doença e das capacidades do laboratório. As infecções virais modernas são baseadas em métodos expressos que permitem obter uma resposta algumas horas após a coleta de material clínico nos estágios iniciais após a doença. a classe lgM, etc.

A microscopia eletrônica de vírus corados negativamente permite a diferenciação dos vírus e a determinação de sua concentração. O uso da microscopia eletrônica no diagnóstico de infecções virais é limitado àqueles casos em que o número de partículas virais no material clínico é suficientemente alto (10 5 em 1 ml e mais alto). A desvantagem do método é a incapacidade de distinguir entre vírus pertencentes ao mesmo grupo taxonômico. Esta desvantagem é eliminada usando microscopia eletrônica imune. O método baseia-se na formação de imunocomplexos quando se adiciona soro específico às partículas virais, enquanto ocorre a concentração simultânea das partículas virais, o que permite identificá-las. O método também é usado para detectar anticorpos. Para fins de diagnóstico expresso, é realizado um exame microscópico eletrônico de extratos de tecidos, fezes, fluidos e segredos da nasofaringe. A microscopia eletrônica é amplamente utilizada para estudar a morfogênese do vírus; suas capacidades são ampliadas com o uso de anticorpos marcados.

O método de hibridização molecular, baseado na detecção de ácidos nucleicos específicos de vírus, permite detectar cópias únicas de genes e não tem igual em termos de sensibilidade. baseado na hibridização de fitas complementares ou RNA (sondas) e na formação de estruturas de fita dupla. A sonda mais barata é o DNA recombinante clonado. marcado com precursores radioativos (geralmente fósforo radioativo). O uso de reações colorimétricas é promissor. Existem várias opções de hibridização molecular: hibridização pontual, hibridização blot, hibridização sanduíche, in situ, etc.

Os anticorpos da classe lgM aparecem mais cedo do que a classe G (no 3-5º dia da doença) e desaparecem após algumas semanas, então sua detecção indica uma infecção recente. Os anticorpos da classe IgM são detectados por imunofluorescência ou imunoensaio enzimático usando anti-soros anti-μ (soros anti-IgM de cadeia pesada).

Para identificar antígenos individuais de vírus e anticorpos para eles em misturas complexas sem purificação prévia de proteínas, é usado o immunoblotting. O método combina o fracionamento de proteínas usando eletroforese em gel de poliacrilamida com subsequente imunoensaio de proteínas por imunoensaio enzimático. A separação de proteínas reduz os requisitos de pureza química do antígeno e possibilita a identificação de pares individuais - anticorpos. Essa tarefa é relevante, por exemplo, no sorodiagnóstico da infecção pelo HIV, onde as reações de imunoensaio enzimático falso-positivo são devidas à presença de anticorpos contra antígenos celulares, que estão presentes como resultado da purificação insuficiente das proteínas virais. anticorpos nos soros de pacientes para antígenos virais internos e externos permite determinar o estágio da doença e na análise de populações - proteínas virais. O imunoblotting na infecção pelo HIV é usado como um teste de confirmação para detectar antígenos virais individuais e anticorpos para eles. Ao analisar populações, o método é usado para determinar a variabilidade das proteínas virais. O grande valor do método está na possibilidade de analisar antígenos sintetizados por tecnologia de DNA recombinante, estabelecendo seu tamanho e a presença de determinantes antigênicos.

Bibliografia: Bukrinskaya A.G. , M., 1986; Virologia, Métodos, ed. B. Meikhi, . de English, M., 1988; Manual de métodos de pesquisa microbiológica e virológica, ed. M.O. Birger, M., 1982.

1. Pequena enciclopédia médica. - M.: Enciclopédia Médica. 1991-96 2. Primeiros socorros. - M.: Grande Enciclopédia Russa. 1994 3. Dicionário enciclopédico de termos médicos. - M.: Enciclopédia Soviética. - 1982-1984.

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ESTUDOS VIROLÓGICOS- estudos realizados com o objetivo de diagnosticar infecções virais, estudando os patógenos relevantes, sua distribuição na natureza, bem como na produção de preparações virais. Em laboratórios virológicos (ver) mel. perfil estudam tanto vírus humanos quanto, em alguns casos, vírus animais (por exemplo, diagnosticam raiva em cães, examinam animais usados para a produção de preparações virais). Os métodos de pesquisa de ambos são semelhantes.

Uma das principais etapas de V. e. é o isolamento de vírus. Ao isolar vírus de pessoas, sangue, vários segredos e excreções e pedaços de órgãos são usados. Na maioria das vezes, o sangue é examinado em doenças de arbovírus. Sangue inteiro desfibrinado ou hemolisado, seus elementos individuais ou coágulos (nos estágios finais da doença) são usados. Vírus da raiva, epid, caxumba, herpes simples podem ser encontrados na saliva. Swabs nasofaríngeos são usados para isolar patógenos de influenza, sarampo, psitacose, rinovírus, vírus sincicial respiratório, adenovírus. Os adenovírus também são encontrados em lavagens da conjuntiva. A lavagem é feita lavando o nariz e a faringe (separadamente) e lavando a conjuntiva com solução isotônica de cloreto de sódio. Você pode limpar as passagens nasais e a parede posterior da faringe com cotonetes umedecidos com caldo. O material não estéril é tratado com antibióticos (1000 UI de penicilina e estreptomicina por 1 ml) por 30 minutos. Vários enterovírus, adenovírus e reovírus são isolados das fezes. As amostras são diluídas 1:10 com tampão fosfato, centrifugadas duas vezes durante 20 minutos. a 8000 rpm I min. Os antibióticos são adicionados como acima. Menos frequentemente para V. e. eles pegam o conteúdo de pústulas (para varíola, varicela, herpes) e pontos de órgãos (para linfogranuloma venéreo). O material seccional deve ser colhido o mais rápido possível após a morte do organismo. Ele é armazenado até o momento da pesquisa em t°-20° e abaixo. Para a realização de V. e. o tecido é esmagado (esfregado) e uma suspensão de 10-20% é preparada em uma solução isotônica de cloreto de sódio ou um meio nutriente para culturas de células. É centrifugado por 20 minutos. a 1500 rpm; o sobrenadante é usado para pesquisas adicionais.

Para isolar vírus, eles infectam animais de laboratório, embriões de aves, culturas de células e tecidos. Os animais são elegíveis se o vírus causar sintomas clínicos claros ou alterações patológicas neles (por exemplo, paralisia, pneumonia, etc.). A eficácia de uma ou outra via de introdução do material depende do tropismo do vírus. Infecção amplamente utilizada sob a pele, por via intraperitoneal e intravenosa. Os vírus neurotrópicos são detectados quando os animais são infectados nos hemisférios cerebrais (arbovírus, vírus da raiva, etc.), no tálamo (vírus da pólio em experimentos com macacos) e na medula espinhal. Os vírus da varíola e do herpes podem ser detectados aplicando o material em coelhos na córnea escarificada. Alguns vírus são facilmente detectados por inoculação na câmara anterior do olho (por exemplo, vírus da hepatite canina em cachorros). Para estudar os agentes causadores de infecções respiratórias, geralmente é usada infecção intranasal de animais (instilação de material no nariz de animais anestesiados ou sua introdução na forma de aerossol em uma câmara especial). O material é introduzido no trato digestivo com alimentos ou pela boca com uma agulha romba. Ao estudar alguns vírus oncogênicos, é usado o método de infectar hamsters dourados na membrana mucosa das bolsas da bochecha.

Animais recém-nascidos e lactentes são mais suscetíveis a muitos vírus do que indivíduos maduros. Camundongos lactentes são amplamente utilizados para o isolamento de arbovírus e Coxsackievírus (após infecção no cérebro). Alguns adenovírus são capazes de induzir tumores quando infectados por via subcutânea com hamsters dourados recém-nascidos. O estudo de vários vírus aviários é realizado em galinhas dos primeiros dias de vida.

O uso de embriões de pintinho tem várias vantagens. Seus tecidos indiferenciados têm uma ampla gama de sensibilidade a muitos vírus. A presença de infecção é julgada pela morte de embriões, pelo aparecimento de alterações (pockmarks) na membrana cório-alantóica (Fig. 1), pelo acúmulo de hemaglutininas e antígenos virais de ligação ao complemento nos fluidos embrionários. Os embriões são infectados na membrana corionallantoica (aos 11-12 dias de idade com vírus do grupo da varíola), nas cavidades alantóicas e amnióticas (com mixovírus de 10-11 dias), no saco vitelino (aos 5-6 dias de idade) com patógenos de psitacose ornitose, etc.). A inoculação do material em embriões no cérebro e por via intravenosa (nos vasos das membranas) raramente é realizada. Com qualquer método de infecção, os embriões podem ser feridos, portanto, mortes nas primeiras 24-48 horas. excluído da conta.

Para estudar o efeito em vírus, chem. substâncias, os ovos desembrionados são muito convenientes, nos quais o embrião é removido, mas a membrana corioalantóica é preservada. O vírus e a substância de teste são colocados em 20 ml de solução isotônica de cloreto de sódio. O orifício na concha é fechado com uma tampa com um tubo, através do qual você pode coletar amostras para análise.

Ao avaliar experimentos em animais e embriões de aves, deve-se ter em mente a possibilidade de provocar neles infecções latentes ou isolar um vírus que esteja em estado latente.

Excepcionalmente amplamente utilizado para o isolamento e acumulação de vírus em culturas de células e tecidos (ver). A maioria dos vírus conhecidos pode ser cultivada por esses métodos (consulte Cultivo de vírus). Alguns deles se acumulam intensamente já durante a infecção primária das culturas, enquanto outros requerem várias passagens para se adaptar. A reprodução da maioria dos vírus em culturas de células é acompanhada pelo desenvolvimento de um efeito citopático. Por sua natureza, até certo ponto, é possível julgar a pertença dos vírus a um ou outro gênero: os picornavírus causam arredondamento e enrugamento das células, adenovírus - a formação de cachos na forma de uvas por células arredondadas, mixovírus e herpética vírus - a formação de sincícios multinucleares. Vários vírus não podem ser cultivados fora do corpo.

A reprodução de alguns vírus (varíola, mixo e arbovírus) pode ser detectada pela reação de hemadsorção, pois as células afetadas adquirem a capacidade de adsorver eritrócitos. Os eritrócitos apropriados (humano, macaco, cobaia, galinha) a uma concentração de 0,4-0,5% são colocados numa monocamada a 4°C ou à temperatura ambiente durante 20-30 minutos. Os eritrócitos são adsorvidos difusamente por toda a cultura (por exemplo, vírus da parainfluenza) ou formam ilhotas (vírus da gripe, caxumba).

A reprodução do vírus às vezes é julgada pelo estudo do fluido de cultura em animais (encefalite transmitida por carrapatos) ou em RSK. A presença de um vírus que não tem atividade citopática é algumas vezes determinada por sua capacidade de interferir com um vírus citopatogênico. Assim, em culturas de células de embriões de galinha infectados com vírus da leucemia aviária, a multiplicação do vírus do sarcoma de Rous é suprimida. Para detectar cepas não citopatogênicas dos vírus da diarreia bovina e da cólera suína, foi proposto o método END (exaltação do vírus da doença de Newcastle), superinfecção de culturas com o vírus da doença de Newcastle. Com a ação combinada de ambos os vírus, ocorre a destruição celular.

Se aparecerem alterações citopáticas ou outros sinais de multiplicação viral, o fluido de cultura é usado para identificar o vírus ou a passagem. Vários vírus permanecem associados às células mesmo quando a cultura está degenerada (adenovírus, vírus do grupo da varíola), pelo que as culturas são congeladas e descongeladas antes da coleta do líquido. Alguns vírus do herpes, como o vírus da doença de Marek em galinhas, devem ser subcultivados com células intactas.

Para estudar os vírus corona respiratórios humanos e alguns outros, é utilizado o método de cultura de tecidos, ou seja, infecção de fragmentos de tecidos cultivados in vitro. O tecido mais comumente usado é a traqueia de coelho. O vírus replicante infecta as células endoteliais da membrana mucosa, o que é determinado pela cessação do movimento dos cílios.

Deve-se considerar a presença de vírus estranhos em culturas de tecidos e células. Eles podem ser introduzidos com células se estas forem retiradas de um organismo infectado, provenientes de tripsina ou soro usado para cultura de células.

Além da semeadura de material de biópsia ou seccional em culturas já crescidas, utiliza-se o cultivo direto das células do órgão em estudo após sua tripsinização, o que muitas vezes é mais eficaz em termos de isolamento do vírus (por exemplo, detecção de adenovírus nas amígdalas). Uma técnica de cultura mista também é utilizada, quando as células do órgão em estudo são cultivadas em conjunto com quaisquer células suscetíveis a este vírus (por exemplo, semear células cerebrais de pacientes com panencefalite esclerosante subaguda junto com células de rim de macaco ou células Hela para isolar a vírus do sarampo). O método de cultura mista é muitas vezes a única maneira de isolar o vírus de tumores induzidos por ele em animais que não produzem vírus ativo, mas contêm o genoma viral.

As culturas de células de camada única permitem a obtenção de colônias de vírus - placas (Fig. 2). Como regra, as placas formam vírus com atividade citopática. Ao mesmo tempo, este método permite a detecção de alguns vírus não citopatogênicos (por exemplo, várias cepas de vírus da diarréia bovina). Para obter as placas, o vírus é aplicado na monocamada de células em copos ou frascos planos. A multiplicidade de infecção, ou seja, o número de partículas virais por célula, deve ser pequena para que as placas formadas não se fundam. Após 30-60 min. camada de adsorção meio nutriente com 1,35 - 1,5% de ágar e vermelho neutro em uma diluição final de 1: 40.000. Culturas em placas de Petri são incubadas em atmosfera com 5-10% de dióxido de carbono e frascos hermeticamente fechados - em um termostato convencional. Alguns dias depois, focos não corados de células degeneradas começam a se destacar entre as células coradas intravitalmente.

É possível colocar ágar sem vermelho neutro nas células, e após alguns dias aplicar uma segunda camada de ágar com corante; as placas tornam-se visíveis após algumas horas. O ágar às vezes contém sulfatos de polissacarídeos, que são inibidores do crescimento viral; para neutralizá-los, adiciona-se sulfato de protamina (60 mg por 100 ml) ao meio. Para obter placas de vários vírus, a metilcelulose e outras substâncias podem ser usadas como revestimento. Alguns vírus (varíola, sarampo) formam placas mesmo sem revestimento de ágar. O método da placa permite a análise clonal de cepas virais. Para isolar clones geneticamente homogêneos, uma placa é removida, que é usada para a próxima infecção. Normalmente, a clonagem é realizada em três passagens.

O método da placa também é útil para determinar o número de células produtoras de vírus (isto é, o número de centros infecciosos) em uma cultura infectada. Para fazer isso, as células são suspensas, colocadas em uma cultura de camada única de células indicadoras sensíveis a vírus e despejadas em ágar. As placas se formam ao redor das células infectadas.

A reação de precipitação em gel é usada para diagnosticar infecções virais e estudar a estrutura antigênica dos vírus. Na maioria das vezes, o ágar é usado para esse fim. Antígenos e anticorpos específicos, colocados em gel de ágar a uma certa distância, se difundem e formam um precipitado na forma de faixas brancas quando se encontram. Agar 0,8-1% em solução isotônica de cloreto de sódio ou tampão fosfato é colocado em capilares ou em camadas em lâminas de vidro. Os antígenos são preferencialmente purificados e concentrados. Os ingredientes da reação são adicionados ao ágar em extremidades opostas do capilar ou em poços feitos na camada de ágar em lâminas a uma distância de 5-6 mm. A incubação dura 4-20 horas.

Um número significativo de V. e. realizado por microscopia de luz e eletrônica. Os maiores vírus (por exemplo, varíola) após processamento adequado (prateamento, coloração Victoriablau, etc.) podem ser detectados com microscopia de luz convencional. Este método é usado no diagnóstico de varíola examinando material de pústulas. A característica de algumas infecções é a formação de corpos nas células - inclusões. Assim, as inclusões aparecem nos núcleos durante infecções herpéticas e adenovirais, no citoplasma - com varíola (corpos de Guarnieri) e raiva (corpos de Babes-Negri). A detecção de inclusões é importante para o diagnóstico de raiva, varíola, citomegalia, panencefalite esclerosante subaguda, etc.

Microscopia em campo escuro (ver. Microscopia de campo escuro) e microscopia de contraste de fase (ver) use o cap. arr. estudar a dinâmica das mudanças nas células afetadas pelo vírus. Aplicar microscopia fluorescente mais amplamente (ver).

Examine esfregaços, impressões e culturas de células de camada única cultivadas em vidros. As preparações (nativas ou fixas) são mais comumente coradas com laranja de acridina. O método permite detectar grandes vírus e clusters de componentes virais. As formações que contêm DNA brilham em verde brilhante e aquelas que contêm RNA brilham em vermelho tijolo. Ainda mais muitas vezes em V. e. as células infectadas são tratadas com anticorpos fluorescentes, o que permite detectar acúmulos do antígeno viral. O método direto usa imunoglobulina gama marcada com um corante fluorescente, como isotiocianato de fluoresceína. No método indireto, a preparação é tratada com o soro imune usual de um animal e, em seguida, com anticorpos marcados contra a gamaglobulina desse animal. As preparações são vistas em luz ultravioleta, o antígeno viral é detectado por um brilho verde claro (veja Imunofluorescência). O método de esfregaços da nasofaringe permite o diagnóstico precoce de infecções virais respiratórias - influenza, parainfluenza, rinoceronte e adenovírus, sincicial respiratório.

Química a composição dos vírus é examinada por química geralmente aceita. métodos. O ácido nucleico é geralmente obtido por extração de fenol, menos frequentemente são usados detergentes aniônicos - dodecil ou lauril sulfato de sódio.

Para a identificação de vírus (ver) em primeiro lugar é necessário estabelecer o seu gênero. Para fazer isso, é necessário determinar o tamanho e a estrutura das partículas virais, o tipo de ácido nucleico incluído em sua composição, a presença de uma membrana lipóide. O tipo de ácido nucleico é mais frequentemente determinado por métodos indiretos, por exemplo, usando a capacidade da bromodesoxiuridina de suprimir a reprodução de vírus contendo DNA. A presença de um envelope lipóide em um vírus é determinada por sua sensibilidade à ação do éter e do clorofórmio (os vírus com envelope são inativados). A identificação adicional é realizada com um conjunto de soros imunes a vírus conhecidos, usando várias reações - neutralização, RSK, RTGA, etc. Menos comumente, os animais são imunizados com um vírus conhecido com sua infecção adicional por um desconhecido, ou vice-versa.

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Pesquisa para o diagnóstico de doenças de natureza viral. Isso é necessário para identificar o vírus, estudar sua biologia e capacidade de afetar células animais e humanas. Assim, torna-se possível compreender a patogênese das doenças virais e, consequentemente, escolher o método de tratamento adequado.

Qual é o diagnóstico?

em células vivas. Para investigá-lo, é necessário cultivá-lo ao nível de um organismo experimental ou Para isso, são realizados métodos de pesquisa virológica na prática médica e na microbiologia em geral, que têm as seguintes abordagens principais:

direto;
indireto;
sorológico.

O material pode ser examinado diretamente quanto à presença de ácidos nucleicos, antígeno viral ou, por exemplo, para isolar e identificar o vírus do material clínico.

Além da capacidade de estabelecer a etiologia da doença, monitorando o efeito terapêutico, os métodos de pesquisa virológica desempenham um papel importante nas medidas antiepidêmicas. Para isolamento e uso de embriões de galinha, animais de laboratório ou culturas de células.

Como eles são pesquisados?

O mais rápido é o método direto. Permite detectar um vírus, antígeno ou NA (ácido nucleico) no próprio material clínico. Leva de duas horas a um dia.

EM - microscopia eletrônica. Detecta o vírus diretamente.
IEM - microscopia eletrônica imune. Usa anticorpos específicos para vírus.
RIF - reação de imunofluorescência. Usa anticorpos ligados a corantes. Esses métodos de pesquisa virológica são amplamente utilizados como uma decodificação rápida da etiologia da SARS (infecções virais respiratórias agudas), quando swabs são retirados da membrana mucosa do trato respiratório superior.
ELISA - enzima imunoensaio - determinação de antígenos virais, semelhante ao RIF, mas baseado na marcação enzimática de anticorpos.
RIA - radioimunoensaio. Usa a marcação de anticorpos com radioisótopos para fornecer alta sensibilidade na detecção de antígenos virais.
Hibridização molecular - NK ou isolamento de genomas de vírus usando PCR (reação em cadeia da polimerase).
Citologia - raramente usada, mas para certas infecções, esses métodos virológicos de pesquisa são muito eficazes. Materiais de biópsia, autópsias e esfregaços processados para coloração e análise ao microscópio são examinados.

Qual é o objetivo da pesquisa?

Para o isolamento bem-sucedido dos vírus, o material clínico é coletado de acordo com a patogênese e o mais cedo possível. Muitas vezes, esse processo requer várias passagens antes que certos ensaios virológicos sejam aplicados.

A microbiologia é o estudo dos seres microscópicos. E seu campo não é apenas medicina. É uma ciência fundamental para a agricultura, medicina veterinária, indústria espacial e técnica e geologia.

Mas é claro que tudo é criado para o homem e seu desenvolvimento neste belo planeta. Portanto, é muito importante detectar o perigo a tempo e neutralizá-lo. Os vírus são diferentes das bactérias. São estruturas que entram no corpo e causam a formação de uma nova geração. Eles se parecem com cristais e visam controlar o processo de sua reprodução, embora eles mesmos não se alimentem, não cresçam e não excretem produtos metabólicos.

O vírus pode causar doenças graves em qualquer organismo vivo em que tenha entrado. Além disso, pode evoluir. É por isso que os métodos de pesquisa virológica em microbiologia devem ser desenvolvidos e aprimorados, pois a civilização humana como um todo pode estar ameaçada.

materiais

Para detectar e identificar vírus na medicina, como regra, eles levam:

lavagem nasofaríngea (infecções respiratórias);
rubor e fezes (infecções por enterovírus);
raspagens, o conteúdo das vesículas (lesões de pele, membranas mucosas, como herpes, catapora);
rubores (infecções exantemáticas como sarampo, rubéola);
sangue, líquido cefalorraquidiano (infecções por arbovírus).

Fases

Todas as etapas do método de pesquisa virológica incluem:

coleta de materiais;
seleção, obtenção de um sistema de teste, determinação de sua viabilidade;
infecção do sistema de teste;
indicação do vírus;
determinar o tipo de vírus.

Basicamente, os vírus patogênicos diferem na presença de tecido e especificidade de tipo. Tomemos, por exemplo, o poliovírus, que só se reproduz em primatas (em suas células). Assim, uma cultura de tecido específica é usada para isolar um vírus específico. Se estamos falando de um patógeno desconhecido, seria aconselhável infectar simultaneamente três e, de preferência, quatro culturas de células.

Assim, talvez um deles seja sensível. Para determinar a presença do vírus em culturas infectadas, observe o desenvolvimento de degeneração celular específica, inclusões intracelulares, detecção de um antígeno específico, testes de hemaglutinação e hemadsorção positivos.

Todos os métodos de investigação virológica (diretos e indiretos, sorológicos) devem ser selecionados como os mais adequados para um caso particular de suspeita de infecção.

Os métodos indiretos são baseados no isolamento e identificação do vírus. Eles são trabalhosos, longos, mas precisos.

Sorodiagnóstico

Este diagnóstico refere-se a um método baseado na reação antígeno-anticorpo. Na maioria das vezes, são usados soros de sangue pareados, coletados em intervalos de várias semanas. Se o aumento do título de anticorpos for 4 ou mais vezes, a reação é considerada positiva. Para determinar a especificidade do tipo de um vírus, é usado um teste de neutralização de vírus. Para determinar a especificidade do grupo, você precisa obter a reação de fixação do complemento.

Várias variantes de imunoensaio enzimático, reação de inibição de hemaglutinação, hemaglutinação passiva, hemaglutinação passiva reversa, RIF são amplamente utilizadas. Mesmo na engenharia genética, foi desenvolvido um método para obtenção de anticorpos monoclonais. A especificidade estreita dos monoclones pode ser superada usando vários anticorpos monoclonais para vários determinantes virais. Assim, a especificidade e a sensibilidade do ensaio com a determinação de antígenos foram aumentadas.

Algumas funcionalidades

Hoje, muitos sistemas de teste diferentes foram criados para o diagnóstico imunológico de infecções resultantes da entrada de um vírus em um organismo vivo.

Assim, os métodos de pesquisa virológica são métodos para isolar vírus, estudar suas propriedades e estabelecer sua relação etiológica com determinadas doenças.