В микробиологии окраска по Граму имеет большое значение. Ее применяют для диагностики инфекционных заболеваний, выявления патогенности бактерий. Метод позволяет определить сходные по форме и размеру бактерии, которые относятся к различным видам и родам.

Окраска бактерий по Граму - сложный метод, в котором применяют два вида окраса: основной и дополнительный. В процессе выполнения манипуляции применяют обесцвечивающие вещества, к которым относятся спирты и кислоты.

В микробиологии окраску по Граму проводят трифенилметановой группой красителей. К ней относятся генциановые, метиловый синий, кристаллвиолет. Разные виды бактерий дают разные окрасы, образуя прочные соединения с красителями.

Окрасы

В микробиологии окраска по Граму бывает двух видов: грамположительная и грамотрицательная. В первом случае микроорганизмы дают прочные соединения с красителями и йодом. Во время анализа они не обесцвечиваются при воздействии со спиртом, из-за чего не изменяют своего первоначального фиолетового оттенка.

Грамотрицательные окрасы образуются при воздействии с йодом и легко разрушаются под действием йода. В результате микробы обесцвечиваются, а затем приобретают красный оттенок.

Подготовка материала

По правилам микробиологии, окраска по Граму требует предварительной подготовки материалов. Его необходимо распределить тонким слоем по поверхности стекла. Затем мазок подсушивают и после полного высыхания фиксируют. При этом мазок закрепляется на стекле, что позволяет исключить смывание бактерий красителями. К тому же мертвые микроорганизмы окрашиваются лучше, чем живые.

После подготовки материала подбирают метод окрашивания: физический или химический. Первый предполагает воздействие высокой температуры на микробную клетку. Во время химического способа применяют различные химические вещества, которые вызывают коагуляцию протеинов цитоплазмы.

Подготавливают набор для окраски по Граму, предметные стекла с бактериями. Их берут пинцетом или аккуратно пальцами за ребра мазком вверх, затем проводят пару раз над верхом пламени горелки. Процесс должен занимать пару секунд.

Процесс фиксации химическим методом предполагает использование ацетона, спирта, специальных смесей, жидкость Карнуа. Предметное стекло с высушенным мазком погружают в фиксирующее вещество на пятнадцать минут, затем просушивают на воздухе.

Окрашивание

Окраска мазков по Граму проводится по определенному алгоритму.

1. Сначала на фиксированный мазок наносят основной краситель на пару минут. Во избежание появления осадка процедуру выполняют с использованием фильтровальной бумаги.
2. Краситель удаляется (сливается), убирается бумага. Мазок погружается в раствор Люголя на две минуты или в йодистый раствор по Граму до почернения препарата.
3. Мазок поласкают спиртовым раствором или ацетоном, наливая и сливая его до тех пор, пока и мазок не обесцветится, и жидкость не станет чистой. Это занимает примерно от 30 до 60 секунд.
4. Стекла тщательно промывают дистиллированной водой.

Чтобы определить, есть ли в мазке грамотрицательные бактерии, проводят дополнительно окрашивание фуксином или сафранином. Препараты наносят на две минуты. В конце процедуры стекло промывают, высушивают.

Результаты

Все грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный. Шарообразные формы обычно относятся к грамположительным видам, а извитые формы - отрицательно окрашиваются. Палочковидные бактерии могут быть грамотрицательными и грамположительными.

Чтобы получить максимально достоверные результаты исследований, рекомендуется применять суточные культуры, а также свежеприготовленные растворы для окрашивания.

Механизм окраски позволяет увидеть и оценить физико-химические особенности строения цитоплазмы, клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. У первых содержится много рибонуклеиновой кислоты, белков в цитоплазме, а в клеточных стенках - пептидогликана. Из-за этого во время обработки мазков генцианвиолетом и Люголем у грамположительных видов бактерий образуется прочное соединение ионов йода и красителя.

При обработке спиртами грамположительные микроорганизмы удерживают краситель, а грамотрицательные - обесцвечиваются и окрашиваются дополнительно разведенным фуксином в красный оттенок. Некоторые бактерии способны окрашиваться только на стадии роста.

Применение

Окраску по Граму проводят при анализе вида микроорганизмов в мазках из влагалища и слюны. Этот способ позволяет определить вид микроорганизмов в кале, в плевральной, перитонеальной жидкости и не только. Любые жидкости, где могут содержаться бактерии, исследуют данным методом. После проведения окрашивания врачи подбирают метод лечения, назначая препараты, способные воздействовать на грамположительные или грамотрицательные бактерии.

Микробиология. Окраска по Граму: красители, проведение, результаты — все о путешествиях на сайт

1. Реактивы, используемые при окраске по Грамму, последовательность их нанесения и механизм воздействия на бактериальную окраску

2. Зависимость различного отношения к окраске по Грамму от различий в химическом составе и строении бактериальных клеток. Понятие о тинкториальных свойствах бактерий

Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой - дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет . Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грамотрицательные Грам (-) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Подготовка материала для окраски. Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют.

Фиксация. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации:

Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2с.

Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70-80 °С).

Химический способ фиксации:

Для фиксации мазков применяют метиловый спирт , ацетон , смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % — 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.

Процесс окрашивания

На фиксированный мазок наливают один из основных красителей на 2-3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.


Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1-2 минуты до почернения препарата.


Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном , наливая и сливая его, пока и мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20-40-60 секунд).


Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин.


Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.


Тинкториальные свойства — свойства бактерий, грибов и простейших, характеризующие их способность вступать в реакцию с красителями (см. Красители) и окрашиваться определенным образом.


2. Требования к питательным средам. Приготовление простых питательных сред


1. Назначение питательных сред
   

   Требования, предъявляемые к питательным средам (обеспечение питательными средам (обеспечение питательными средами условий для роста и размножения микробов)
   

   Определение и название простых питательных сред
   

   Этапы приготовления пептонной воды (ПВ), мясо-пептонного бульона (МПБ) и мясо-пептонного агара (МПА). Преимущества и недостатки данных сред
   

   В лабораторных или производственных условиях бактерии выращивают (культивируют) на средах, которые должны удовлетворять потребности бактерий в питательных веществах, иметь адекватное значение величины рН, изотоничность и быть стерильными, а по-возможности и прозрачными. Специфичность большинства питательных сред определяют соединения углерода и азота, но так как конструктивные и энергетические процессы микроорганизмов разнообразны, неодинаковы и их потребности в питательных веществах.
   

   Требования, предъявляемые к питательным средам.
   

   1. Питательные среды должны содержать необходимые для питания микробов питательные вещества.
   

   2. Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба.
   

   3. Питательные среды должны иметь достаточную влажность и вязкость, т.к. микробы питаются по законам диффузии и осмоса.
   

   4. Обладать изотоничностью и иметь определенный окислительно-восстановительный потенциал (гН 2).
   

   5. Питательные среды должны быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур.
   

   Питательные среды принято делить на несколько групп: среды которые отличаются по составу и происхождению, физическому состоянию или консистенции и функциональному или целевому назначению.
   

   По происхождению среды бывают естественными (натуральными ) и искусственными (синтетическими ) . К естественным средам относят те, в состав которых входят продукты растительного или животного происхождения. Они содержат все компоненты, необходимые для роста и развития бактерий, но имеют непостоянный химический состав, то есть они нестабильны. Поэтому такие питательные среды не пригодны для изучения метаболизма бактерий, а используются, в основном, для накопления биомассы, поддержания культур бактерий в жизнеспособном состоянии и для диагностических целей, например, для выделений чистых культур бактерий. К естественным средам относятся молоко, кровь и сыворотка крови, отвары и экстракты из природных субстратов, пептонная и мясная вода, мясо-пептонные бульон и агар, дрожжевые экстракты, картофельные, яичные и желчесодержащие среды.
   

   Синтетические (искусственные) среды имеют определенный химический состав и точное количественное содержание питательных веществ. Их используют для изучения метаболизма бактерий, исследования физиологии и биохимии микроорганизмов. Примером синтетической среды могут служить среды Козера и Симмонса, используемые для изучения способности бактерий утилизировать цитраты. В состав этих сред, наряду с другими солями, входят цитрат натрия и индикатор.
   

   В практике микробиологии, как правило, используются комбинированные питательные среды, в которых сочетаются естественные компоненты с неорганическими солями. Примерами таких сред являются агар Цейсслера, в состав которого входит МПА, кровь и сахар, среды Гисса, содержащие пептон, агар, один из сахаров и индикатор, среда Раппопорта, состоящая из желчного бульона, глюкозы и индикатора.
   

   Среды можно по составу разделить так же на простые и сложные . К простым относятся мясная и пептонная вода, мясо-пептонные бульон и агар. Добавление к таким средам одного или нескольких ингредиентов — углеводов, крови, сыворотки и других составляющих делают их сложными.
   По физическому состоянию питательные среды могут быть жидкими , полужидкими , плотными или твердыми , сыпучими или сухими .
   

   Жидкие среды представлены, как правило, водными растворами необходимых для жизни веществ. Их используют для накопления биомассы, обогащения культур бактерий, изучения метаболизма. Полужидкие и плотные питательные среды получают из жидких, добавляя к ним агар или желатину. Концентрация агара для полужидких сред 0,5-0,7%, а для плотных 1,5-2%.
   

   Полисахарид агар получают из некоторых видов морских водорослей, его высушивают и хранят в виде пластин или порошка. Бактерии не используют агар в качестве субстрата и поэтому состав плотной питательной среды зависит от состава жидкой среды, к которой добавлен агар. Агар плавится примерно при температуре 100 ° С и застывает при 40 ° С. Агаризированные среды разливают в пробирки или чашки Петри в расплавленном состоянии, а затем охлаждают. Для уплотнения сред иногда используют желатину, добавляя ее к жидким средам в 10-20% концентрации. Применение желатины ограничено тем, что она разжижается протеолитическими ферментами бактерий и ее применяют, в основном, в питательных средах для диагностических целей. Для уплотнения сред используют, кроме того, селикогель и каррагенан, получаемый из красных морских водорослей. Пластины геля, пропитанные питательной средой, используют для культивирования бактерий-автотрофов.
   

   Сухие питательные среды представляют смеси составляющих питательных сред определенного состава. Перед использованием их растворяют в воде в соответствии с инструкцией, указанной на этикетке, устанавливают необходимое значение рН и стерилизуют. Применение сухих питательных сред облегчает работу по приготовлению сложных сред в лабораториях.
   

   По целевому назначению питательные среды делят на несколько групп:
   

   – основные или универсальные простые среды, например, МПА, МПБ; на них могут расти многие виды неприхотливых микроорганизмов;
   

   – специальные или сложные среды используют для культивирования тех бактерий, которые не могут расти на основных простых средах; в состав специальных сред вводят, например, углеводы для роста стрептококков, желчь для культивирования сальмонелл, дефибринированную кровь для дифтерийной палочки.
   

   Пептонная вода — жидкая питательная среда, состоящая из 0,5-1% пептона, 0,5% натрия хлорида, растворенных в дистиллированной воде. Применяют как среду обогащения для холерного вибриона (рН около 9), основу для приготовления сахарных (рН 7,4) и др. сред. Стерилизуют Пептонную воду. при 120°С в течение 20 мин
   

   Мясопептонный бульон (МПБ). Для приготовления мясо — пептонных сред используют мясной бульон , который получают так: 500 г мелко изрубленного свежего мяса без костей, жира и сухожилии заливают в эмалированной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50°С, и оставляют настаиваться 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 50-55°С.
   

   Мясо отжимают, экстракт процеживают через марлю со слоем ваты, кипятят в течение 30 мин для свертывания коллоидных белков и фильтруют дважды (первый раз через марлю с ватой, второй - через бумажный фильтр). Фильтр доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин (пробки колб закрывают сверху колпачками из бумаги). Ватные пробки должны быть плотными, так как они являются фильтром, препятствующим проникновению бактерий из воздуха после стерилизации. Мясной бульон может быть использован в любое время для приготовления соответствующих сред. Если их готовят сразу, то предварительная стерилизация излишня. Нередко в лабораторных условиях мясной настой кипятят вместе с мясом, а затем мясо отжимают. Бульон получается хорошего качества. Если желательно иметь мясной бульон особо высокой питательности, во время настаивания мяса с водой добавляют немного пепсина и подкисляют бульон соляной кислотой. Пепсин дополнительно гидролизует белковые соединения мяса, и количество усвояемых бактериями питательных веществ возрастает.
   

   Мясо можно заменить мясным экстрактом, беря его по 5 г на 1 л среды. Для приготовления мясопептонного бульона к 1 л мясного бульона добавляют 5-10 г пептона (пептон - первый продукт гидролиза белка с высокой молекулярной массой) для повышения калорийности среды и 5 г поваренной соли с целью создания осмотической активности. Среду нагревают до растворения пептона, постоянно помешивая. Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды, приливая 20%-ный раствор NagCOa (до посинения влажной красной лакмусовой бумажки; при этом фенолфталеин еще не показывает щелочную реакцию - при добавлении его к среде в фарфоровой чашке розовая окраска не выявляется). Удобно использовать индикатор бромтимолблау. 1-2 капли его вносят стеклянной палочкой в фарфоровую чашку и добавляют каплю бульона. В нейтральной среде бромтимолблау бутылочно-зеленый, в кислой - желтый, в щелочной - синий. После установления реакции среду снова кипятят 5-10 мин и белки, свернувшиеся от изменения реакции, отфильтровывают через бумажный фильтр без осветления бульона или осветлив его белком.
   

   Прозрачный мясо — пептонный бульон разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С в течение 20 мин
   

   Мясо — пептонный агар (МПА). К 1 л мясо —пептонного бульона добавляют 15-20 г мелко нарезанного агар-агара. Среду нагревают до растворения агара (температура плавления его 100°С, застывания -40°С),устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na2COa и через воронки разливают в пробирки (но 10 мл для разливок в чашки - агар столбиком и по 5 мл для получения скошенного, наклонного агара). При разливе агара необходимо следить затем, чтобы края пробирки были сухими, иначе пробки прилипают к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 20 мин.
   

   14. Санитарно-биологический контроль дистиллированной воды. Понятие о пирогенности
   

   1. Микробное число воды. Методика его определения. Критерии чистоты дистиллированной воды
   

   2. Пирогенны. Химическая природа, просихождение, физические, биологические свойства, действие на организм.
   

   3. Меры по предотвращению пирогенности инъекционных лекарственных средств.
   

   В связи с тем, что определение патогенных бактерий при биологическом анализе воды представляет собой непростую и трудоемкую задачу, в качестве критерия бактериологической загрязненности используют подсчет общего числа образующих колонии бактерий (Colony Forming Units — CFU) в 1 мл воды. Полученное значение называют общим микробным числом.
   

   В основном для выделения бактерий и подсчета общего микробного числа используют метод фильтрации через мембрану.
   

   
   

   Рисунок 1– Иллюстрация метода фильтрации через мембрану
   

   При этом методе анализа воды определенное количество воды пропускается через специальную мембрану с размером пор порядка 0.45 мкм. В результате, на поверхности мембраны остаются все находящиеся в воде бактерии. После чего мембрану с бактериями помещают на определенное время в специальную питательную среду при температуре 30-37 о С.
   

   Во время этого периода, называемого инкубационным, бактерии получают возможность размножиться и образовать хорошо различимые колонии, которые уже легко поддаются подсчету.
   

   Так как такой метод анализа воды предполагает только определение общего числа колонии — образующих бактерий разных типов, то по его результатам нельзя однозначно судить о присутствии в воде патогенных микробов. Однако, высокое микробное число свидетельствует об общей бактериологической загрязненности воды и о высокой вероятности наличия патогенных организмов.
   

   Пирогенны — это бактериальные эндотоксины или фрагменты микробных тел, например, клеточных стенок. Пирогены, наряду с вирусами могут загрязнять воду делая её непригодной для некоторых применений (приготовление инъекционных растворов). Пирогенные вещества в воде могут определяться как традиционным способом путём введения кроликам и наблюдения за изменением температуры тела, так и современным, более чувствительным и надёжным специфическим тестом с использованием амёбоцитов, полученных из крови мечехвоста. Пирогены вызывают резкое повышение температуры при инъекции млекопитающим, в том числе и человеку и препятствуют развитию клеточных культур и культур тканей. Пирогены и вирусы могут быть удалены из воды путём дистилляции, ультрафильтрации, обратного осмоса и адсорбции.
   

   В производстве инъекционных препаратов от пирогеннов освобождаются различными физико-химическими методами – путем пропускания раствора через колонки с активированным углем, целлюлозой, мембранные ультрафильтры.
   

   17. Живые вакцины: получение, применение, достоинства, недостатки
   

2. Вакцины, их назначение
   

   Живые вакцины (аттенуированные, дивергентные, векторные, рекомбинантные), получение, примеры.
   

   Преимущества и недостатки живых вакцин.
   

   Вакцины (лат. vaccinus коровий) - препараты, получаемые из микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности; применяются для активной иммунизации людей и животных с профилактической и лечебной целями. Вакцины состоят из действующего начала - специфического антигена; консерванта для сохранения стерильности (в неживых вакцинах.); стабилизатора, или протектора, для повышения сроков сохраняемости антигена; неспецифического активатора (адъюванта), или полимерного носителя, для повышения иммуногенности антигена (в химических, молекулярных вакцинах). Специфические антигены, содержащиеся в вакцинах, в ответ на введение в организм вызывают развитие иммунологических реакций, обеспечивающих устойчивость организма к патогенным микроорганизмам. В качестве антигенов при конструировании вакцины используют: живые ослабленные (аттенуированные) микроорганизмы; неживые (инактивированные, убитые) цельные микробные клетки или вирусные частицы; извлеченные из микроорганизмов сложные антигенные структуры (протективные антигены); продукты жизнедеятельности микроорганизмов - вторичные метаболиты (например, токсины, молекулярные протективные антигены): антигены, полученные путем химического синтеза или биосинтеза с применением методов генетической инженерии.
   

   В соответствии с природой специфического антигена вакцины делят на живые, неживые и комбинированные (как живые, так и неживые микроорганизмы и их отдельные антигены). Живые вакцины получают из дивергентных (естественных) штаммов микроорганизмов, обладающих ослабленной вирулентностью для человека, но содержащих полноценный набор антигенов (например, вирус коровьей оспы), и из искусственных (аттенуированных) штаммов микроорганизмов. К живым вакцинам можно отнести также векторные вакцины, полученные генно-инженерным способом и представляющие собой вакцинный штамм, несущий ген чужеродного антигена (например, вирус оспенной вакцины со встроенным антигеном вируса гепатита В).
   

   Живые вакцины — аттенуированные (ослабленные) штаммы вирусов или бактерий. Аттенуированные — ослабленные в своей вирулентности инфекционной агрессивности), т.е. искусственно модифицированные человеком или «подаренные» природой, изменившей их свойства в явственных условиях, примером чего служит осповакцина. Действующим фактором таких вакцин являются изменённые генетические признаки микроорганизмов, в то же время обеспечивающие перенесение ребенком «малой болезни» с последующим приобретением специфического противоинфекционного иммунитета.
   

   Другими словами, вакцинные варианты живых микроорганизмов — это те из них, которые утрачивают исходную патогенность, присущую штаммам, циркулирующим в природе. Но, оставаясь жизнеспособными) они индуцируют образование специфической резистентности по той же схеме, как это происходит при естественно-инфекционном процессе. Пример: после прививки БЦЖ — против туберкулеза. Существенное отличие состоит в том, что перенесение инфекционного заболевания естественным путем, которое может протекать и в скрытой (стертой) форме (дифтерия, полиомиелит, паротит и др.), обеспечивает, как правило, пожизненную невосприимчивость. Повторное заболевание отмечено всего лишь у пяти процентов. При вакцинации живыми вакцинами искусственно приобретенный иммунитет непродолжителен, что обусловливает дополнительное неоднократное повторение процедуры прививок.
   

   Рекомбинантные генно-инженерные вакцины — новая продукция в профилактике инфекционных болезней. Примером такой вакцины является вакцина против гепатита В.
   

   Смысл живых вакцин состоит в том, чтобы воспроизвести в организме натуральную инфекцию в ослабленной форме. Преимуществами живых вакцин является отличная профилактическая эффективность, а к недостаткам следует отнести невозможность применения их у детей и больных хроническими заболеваниями, невозможность применения таких вакцин во время эпидемии.
   

   Наиболее просты в изготовлении живые вакцины, так как технология в основном сводится к выращиванию аттенуированного вакцинного штамма с соблюдением условий, обеспечивающих получение чистых культур штамма, исключение возможностей загрязнения другими микроорганизмами (микоплазы, онковирусы) с последующей стабилизацией и стандартизацией конечного препарата. Вакцинные штаммы бактерий выращивают на жидких питательных средах (гидролизаты казеина или другие белково-углеводные среды) в аппаратах - ферментаторах емкостью от 0,1 м 3 до 1-2 м 3 . Полученная чистая культура вакцинного штамма подвергается лиофильному высушиванию с добавлением протекторов. Вирусные и риккетсиозные живые В. получают выращиванием вакцинного штамма в эмбрионах кур или перепелов, свободных от вирусов лейкоза, либо в культурах клеток, лишенных микоплазм. Используют или первично-трипсинизированные клетки животных или перевиваемые диплоидные клетки человека. Живые аттенуированные штаммы бактерий и вирусов, применяемые для приготовления живых вакцин, получены, как правило, из природных штаммов путем их селекции или пассажей через биологические системы (организм животных, эмбрионы кур, культуры клеток, питательные среды).
   

   В связи с успехами генетики и генетической инженерии появились возможности целенаправленного конструирования вакцинных штаммов. Получены рекомбинантные штаммы вируса гриппа, а также штаммы вируса вакцины со встроенными генами протективных антигенов вируса гепатита В. Инактивированные корпускулярные бактериальные В. или цельновирионные инактивированные В. получают соответственно из культур бактерий и вирусов, выращенных на тех же средах накопления, что и в случаях получения живых вакцин, и затем подвергнутых инактивации нагреванием (гретые вакцины), формалином (формолвакцины), ультрафиолетовым излучением (УФ-вакцины), ионизирующим излучением (радиовакцины), спиртом (спиртовые вакцины). Инактивированные вакцины ввиду недостаточно высокой иммуногенности и повышенной реактогенности не нашли широкого применения.
   

   3. Характеристика возбудителей лептоспирозов: эпидемиология, патогенез, клиника, иммунитет. Принципы микробиологической диагностики. Препараты для специфической профилактики и лечения
   

   1. Характеристика возбудителей: а) таксономия; б) морфологические и тинкториальные свойства; в) антигенная структура; г) культивирование; д) биохимические (ферментативные) свойства; е) факторы патогенности; ж) резистентность; з) патогенность для животных.
   

   2. Эпидемиология: а) источник инфекции; б) механизм передачи; в) восприимчивость населения.
   

   3. Патогенез заболевания.
   

   4. Клиническая картина.
   

   5. Иммунитет.
   

   6. Лабораторная диагностика: бактериоскопический, бактериологический, биологический и серологический методы.
   

   7. Лечение (в т.ч. специфическое).
   

   8. Неспецифическая и специфическая профилактика.
   

   К лептоспирозам относят все те инфекционные заболевания людей, домашних и диких животных (в основном из класса млекопитающих), которые вызываются спирохетами рода лептоспира (Leptospira).
   

   Лептоспирозы вызываются различными видами лептоспир, отличающимися друг от друга, прежде всего своими серологическими свойствами (по антигенному строению).
   

   Хранителями (резервуарами) лептоспир в природе являются животные-дикие (грызуны, насекомоядные, хищные) и домашние (рогатый скот, лошади, свиньи и собаки).
   

   Лептоспирозы передаются человеку от животных и потому их относят к группе зоонозов.
   

   Эпидемиологически лептоспирозы характеризуются преимущественно водным путем распространения. С этой точки зрения лептоспироз можно охарактеризовать, как «болезнь грязной воды», в том смысле, что в такой воде содержится некоторое количество мочи, с которой лептоспиры выделялись из организма.
   

   Циркуляция патогенных лептоспир в природе происходит, в основном следующим образом: из организма животных-больных и носителей-во внешнюю среду и, в частности, в водоемы, а затем из внешней среды вновь в организм животных, а иногда и в организм людей. Человек для патогенных лептоспир в эпидемиологическом отношении в большинстве случаев оказывается «тупиком».
   

   Таксономическим критерием для классификации штаммов лептоспир на внутривидовом уровне служит их антигенный состав. В качестве стандартного метода для определения сероваров используют выявляемую с помощью световой микроскопии реакцию агглютинации с перекрестной адсорбцией агглютининов. Для удобства близкие по составу антигенов серовары объединены в серогруппы. В настоящее время (Справочник Берджи 1997 г.) патогенные лептоспиры разделены на 38 серогрупп и 65 сероваров. Идентификация выделенных штаммов лептоспир проводится в справочных лептоспирозных лабораториях.
   

   Лептоспиры-микроорганизмы спиралевидной формы. Обычно длина их составляет 6-24 мкм, а диаметр-до 0,2 мкм. Концы микроба изогнуты в виде крючков, которые придают ему своеобразный, легко распознаваемый вид. С помощью электронной микроскопии установлено, что лептоспиры состоят из спирального протоплазматического цилиндра, покрытого цитоплазматической гликопептидной мембраной. Все тело клетки заключено в наружную мембрану между цитоплазматической мембраной и мембраной наружного покрова расположены два жгутика («осевые нити»). Каждый жгутик прикреплен к базальному телу и переплетается с протоплазматическим цилиндром. Их свободные концы расположены около середины клетки. Лептоспиры плохо воспринимают анилиновую краску, поэтому их изучают преимущественно в темном поле зрения в так называемой раздавленной капле. Эти спирохеты имеют вид тонких, оживленно движущихся серебристых нитей. Их движения разнообразны: прямолинейные, вращательные, сгибательные. В сильно вязкой среде движение может происходить по типу волнового, винтового и змеевидного.
   

   Относятся они к хемоорганотрофам, в качестве источника углерода и энергии используют жирные кислоты и жирные спирты с 15 или более атомами углерода. Углеводы или аминокислоты для данных целей не используются. Культивируются в средах, содержащих сыворотку, сывороточный альбумин или жирные кислоты. В средах с 1% агара образуют глубинные колонии, от диффузных до четко очерченных. В средах с 2% агаром колонии поверхностные, от мутных до прозрачных. Оптимальная температура роста 28-30°С, (сапрофитные серовары могут расти при 13°С) рН-7,2-7,6. Инкубационный период для оптимального роста обычно 6-14 дней, но может варьировать от нескольких дней до 4 недель.
   

   Лептоспиры-аэробные микроаэрофильные микроорганизмы. Они могут утилизировать неорганические соли аммония как главный источник азота, а также пуриновые основания.
   

   Размножаются лептоспиры поперечным делением, и происходит это медленнее чем у других бактерий. Максимальной концентрации культура достигает на 6-12-е сутки.
   

   Культивируют лептоспиры чаще всего на жидких питательных средах, содержащих в качестве основного компонента сыворотку крови кролика или овцы.
   

   В воде и влажной почве могут быть обнаружены L. biflexa , морфологически они неотличимы от L. interrpgans .
   

   Важным условием выживания лептоспир во внешней среде является повышенная влажность и рН 7,0-7,6. Они быстро погибают под действием прямых солнечных лучей. В воде открытых водоемов лептоспиры сохраняют жизнеспособность от 7 до 30 дней, а во влажной почве-9 мес. Они чувствительны к действию высоких температур: кипячение убивает их мгновенно, нагревание до 56-60°С в течение 20-25 мин. Напротив, к низким температурам эти микроорганизмы устойчивы, остаются жизнеспособными после длительного замораживания во льду. Лептоспиры чувствительны к кислотам, поэтому для обеззараживания чистых культур рекомендуют 2% раствор соляной кислоты с экспозицией 24 часа, а для патологического материала следует применять 5% раствор фенола в течение 2 часов.
   

   Эпизоотологические данные. Лептоспирозом болеют крупный рогатый скот, буйволы, свиньи, лошади, овцы, козы, олени, собаки, верблюды, кошки, грызуны, пушные звери, насекомоядные, сумчатые и др. Чаще поражаются свиньи и крупный рогатый скот; у молодых животных болезнь протекает тяжелее и с большей летальностью.
   

   Источником возбудителя инфекции являются клинически и бессимптомно больные, а также переболевшие животные-лептоспироносители.
   

   Из организма лептоспиры выделяются с мочой, фекалиями, молоком, спермой, истечениями из половых органов, а также с абортированным плодом. Особенно опасными являются лептоспироносители, длительное время выделяющие лептоспиры с мочой: грызуны-всю жизнь, свиньи-до 2 лет, овцы-до 9 мес., крупный рогатый скот-до 20 мес., собаки-до 3 лет, кошки-до 119 дней, лисицы-до 514 дней. В неблагополучных хозяйствах лептоспироносительство составляет у крупного рогатого скота от 1-2% до 10-50%, у свиней-20-80% и более.
   

   Источником лептоспирозной инфекции для человека являются животные-дикие, домашние и клеточного пушного звероводства.
   

   Люди в большинстве случаев заражаются при купании и использовании для хозяйственных и бытовых нужд воду из открытых водоемов, инфицированной животными-лептоспироносителями, и реже, во время сельскохозяйственных работ на сырых угодьях, охоте, рыбной ловле, при уходе за домашними животными, разделке туш и обработке животного сырья, при употреблении продуктов питания, инфицированных грызунами, а также сырого молока от больных коров.
   

   Территории, на которых выявляется лептоспироз среди животных, следует считать лептоспирозными очагами, потенциально опасными для человека.
   

   Лептоспирозные очаги подразделяются на природные, антропургические и смешанные.
   

   В России в инфекционной патологии человека наибольшее значение имеют природные очаги лептоспироза серогруппы Grippotyphosa и в меньшей степени Pomona, HebdoMadis, Icterohemorragiae .
   

   Заболевания людей в природных очагах характеризуются строгой приуроченностью к летне-осеннему периоду (июнь-сентябрь).
   

   В хозяйствах, где преобладают свиньи, главная роль в этиологии заболеваний человека принадлежит лептоспирозу серовара monjakov (серогруппа Роmonа ), реже возбудителям групп Tarassovi и Canicola , в хозяйствах преобладанием крупного рогатого скота-сероварам grippotyphosa , pomona , группам Hebdomadis и иногда Tarassovi .
   

   Смешанные очаги проявляются одновременно в виде антропургических и природных. Этиологическая структура заболевания людей отражает таковую, как у домашних, так и у диких животных обитающих в данном очаге.
   

   Кроме указанных типов очагов возможно внутрилабораторное заражение при работе с грызунами и другим животными и непосредственно с культурой лептоспир.
   

   Особенности эпидемиологии в зависимости от свойств возбудителей. Различные возбудители лептоспироза вызывают одинаковые по патогенезу заболевания и могут при определенных условиях поражать разнообразных животных, но они довольно существенно различаются по патогенным свойствам, избирательной привязанности к тем или иным видам животных-хозяев (т. е. по кругу основных носителей инфекции), закономерностям заражения людей, эпидемиологической значимости.
   

   С 1964 г. заболеваемость колебалась в пределах: 0,16 до 5,64 на 100 тысяч населения. Снижение произошло за счет проведения санитарно-ветеринарных мероприятий. В 80-90-е годы заболеваемость колеблется в пределах от 0,1 до 3,4 на 100 тысяч населения.
   

   Патогенез. Воротами инфекции чаще является кожа. Для проникновения лептоспир достаточно малейших нарушений целостности кожи. В связи с этим заражение наступает даже при кратковременном контакте с водой, содержащей лептоспиры. Возбудитель может проникать также через слизистые оболочки органов пищеварения и конъюнктиву глаз. На месте ворот инфекции никаких воспалительных изменений («первичного аффекта») при этом не возникает. Дальнейшее продвижение лептоспир происходит по лимфатическим путям. Ни в лимфатических сосудах, ни в региональных лимфатических узлах воспалительных явлений также не развивается. Барьерная роль лимфатических узлов выражена слабо. Лептоспиры легко их преодолевают и заносятся в различные органы и ткани (преимущественно в печень, селезенку, легкие, почки центральную нервную систему), в которых происходит размножение накопление лептоспир. По времени это совпадает с инкубационным периодом. Эта фаза патогенеза равняется длительности инкубационного периода (от 4 до 14 дней).
   

   Начало болезни (обычно острое) связано с массивным поступлением лептоспир и их токсинов в кровь (при микроскопии крови обнаруживаются десятки лептоспир в поле зрения). Тяжесть болезни и выраженность органных поражений зависит не только от серотипа возбудителя, но и от реактивности макроорганизма. В печени лептоспиры прикрепляются к поверхности клеток, а также находятся в межклеточном пространстве. Часть лептоспир погибает. Лептоспиры, их токсины и продукты обмена приводят к выраженной интоксикации, которая особенно быстро нарастает в первые 2-3 дня от начала болезни. Лептоспиры обладают гемолизином, что приводит к разрушению (гемолизу) эритроцитов. Возбудители и их токсические продукты обладают выраженным действием на сосудистую стенку и на свертывающую систему крови. В тяжелых случаях развивается тромбогеморрагаческий синдром.
   

   Желтуха при лептоспирозе носит смешанный характер. Имеет значение отек печеночной ткани, деструктивные и некротические изменения паренхимы, а также гемолиз эритроцитов. Оcoбoe место в патогенезе лептоспироза занимает поражение почек. В большинстве случаев летальные исходы связаны с развитием острой почечной недостаточности (уремическая кома). Она возникает в результате непосредственного действия лептоспир и их токсических продуктов жизнедеятельности на клеточную стенку приводит к тяжелым повреждениям эпителия почечных канальцев, коркового и подкоркового вещества почек, что приводит к нарушению процессов мочео6разования. Следствием этого является олигурия с возможным развитием уремии. У части больных (10-35%) лептоспиры преодолевают гематоэнцефалический барьер, что приводит к поражению центральной нервной системы, обычно в виде менингитов. Кровоизлияния в надпочниках могут привести к развитию острой недостаточности коры надпочечников. Своеобразным и патогномоничным проявлением лептоспироза является поражение скелетных мышц. Иногда, в результате гематогенного заноса развивается специфическое лептоспирозное поражение легких, глаз, реже других органов.
   

   Клиническая картина лептоспир оза чрезвычайно разнообразна. Однако у всех видов животных можно наблюдать три стадии болезни: продромальную, основных клинических симптомов и выздоровления. Заболевание начинается остро. В стадию продромальных симптомов температура повышается на 2– 3°, появляется слабость, исчезает аппетит. Рогатый скот на пастбище отстает от стада, у лактирующих животных резко снижается удой. Скот обычно стоит безучастный к окружающему; звери и собаки забиваются в угол клетки, предпочитая лежать. Сосуды конъюнктивы в некоторых случаях резко налиты.
   

   Болезненность мускулатуры может быть установлена у лошадей, собак и лисиц. У коров и кобыл в этой стадии бывают аборты. Наряду о потерей аппетита, у плотоядных отмечается рвота пищевыми массами с примесью желчи и крови. Перистальтика или замедляется или делается бурной. У лошадей возникают приступы легких колик. Развивается понос или, наоборот, запор. У собак к калу примешивается кровь.
   

   С появлением основных клинических симптомов: анемия, геморрагический диатез, желтуха, гемоглобинурия, некрозы, температура падает и держится в нормальных или даже субнормальных границах до смерти или выздоровления, и лишь очень редко бывают рецидивы лихорадки о ухудшением состояния больные.
   

   Инкубационный период при лептоспирозах у людей составляет от 3 до 14 дней, чаще всего 7 дней.
   

   Клинически лептоспирозы людей-общие острые лихорадочные, нередко рецидивирующие заболевания типа септицемии. Болезнь начинается внезапно и сопровождается ознобом, высокой температурой, общей слабостью, сильными головными и мышечными болями и поражением прежде всего печени, почек и мелких сосудов; нередко отмечаются геморрагии, сыпь на коже и расстройства со стороны желудочно-кишечного тракта, а в некоторых случаях желтуха.
   

   Течение лихорадки при всех видах лептоспирозов обычно довольно однообразное: быстрое нарастание, непродолжительность, подскоки и рецидивы. Клиническое развитие всех видов лептоспирозов также чаще всего довольно однообразное.
   

   Но в зависимости от функционального состояния организма и вирулентности лептоспир некоторые симптомы заболевания могут проявляться слабее или резче. Это и обусловливает существование различных клинических форм этой болезни (желтушная, геморрагическая, менингеальная, гриппоподобная, рецидивирующая).
   

   Известны случаи, когда заболевания лептоспирозами неправильно диагностировали и не отличали от гриппа, возвратного, сыпного или брюшного тифа, менингококкового менингита, малярии и т. д.; напротив, болезнь Боткина (вирусный гепатит) диагностировали как лептоспироз.
   

   Для лептоспироза человека характерно разнообразие клинических проявлений и выраженная цикличность.
   

   Первая фаза заболевания соответствует инкубационному периоду и продолжается в среднем 7– 14 дней. В это время благодаря активной подвижности лептоспиры быстро проникают в организм, не оставляя патологических изменений в месте входных ворот (в редких случаях развивается региональный лимфаденит). С током крови лептоспиры попадают в паренхиматозные органы-преимущественно в печень, почки, надпочечники, селезенку, легкие. Здесь они интенсивно размножаются. Преодолевая гематоэнцефалический барьер, возбудитель проникает в ликвор и ткани мозга.
   

   Вторая фаза соответствует началу клинических проявлений. В это время происходит накопление лептоспир и их токсических продуктов в крови, что и обусловливает выраженную интоксикацию. Заболевание начинается остро, без продромальных явлений. Появляется озноб, температура тела повышается до 39-40 С и держится повышенной в течение 5-7 дней, носит ремиттирующий или постоянный характер, снижается критически или по типу ускоренного лизиса. После периода апирексии, продолжающегося в среднем от 3 до 11 дней, могут наблюдаться повторные повышения температуры тела. Но в этом случае приступы лихорадки умеренные и более короткие.
   

   С первых дней болезни пациенты жалуются на сильную головную боль, бессонницу, боль в икроножных мышцах, мышцах плечевого пояса, в области груди, спины живота. Боли в мышцах, особенно икроножных, очень интенсивные, возникают в покое, усиливаются при малейшем движении и легкой пальпации. В этот же период появляется тошнота, рвота, горечь во рту, падает аппетит. Появляются боли в животе, которые могут быть настолько интенсивными, что имитируют картину «острого живота».
   

   Больные заторможены, адинамичны. Лицо одутловато, гиперемировано. Склеры инъецированы, возможны кровоизлияния в склеру, на губах и крыльях носа могут появляться герпетические высыпания, нередко с геморрагическим содержимым.
   

   К 3-6-му дню болезни у 2-10% больных на коже груди, живота, спины, конечностей отмечается полиморфная сыпь, которая держится от нескольких часов до 10 дней. После исчезновения сыпи наблюдается легкое шелушение кожи.
   

   Общепризнанно, что с конца первой начала второй недели заболевания наступает третья фаза-наивысшая ступень токсемия, соответствующая развернутой картине болезни и обусловленная поражением практически всех органов и тканей. В основе патологических изменений лежит генерализованный капилляротоксикоз. Он связан с повреждением эндотелия капилляров продуктами метаболизма лептоспир и их токсинами. Имеет место также нарушение системы регуляции агрегатного состояния крови с развитием синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС). Степень выраженности происходящих патологических изменений может быть различной: от легкой до ярко выраженной, при которой развивается гипертоксический вариант лептоспироза, протекающий по типу инфекционно-токсического шока с резким нарушением функции органов.
   

   Лептоспироз всегда сопровождается поражением печени, что проявляется в ее увеличении, болезненности, нарушении углеводной, белковой, пигментной и антитоксической функции. Степень патологических изменений определяет желтушную и безжелтушную форму инфекции. Желтуха разной интенсивности от легкой желтушности склер до ярко оранжевого, иногда шафранного цвета кожи появляется у 30-60% больных.
   

   Поражение почек-важный и почти постоянный симптом лептоспироза, при легком течении заболевания проявляющийся в альбуминурии, цилиндрурии, гематурии. В тяжелых случаях развивается острая почечная недостаточность разной степени выраженности до полной анурии.
   

   Геморрагический синдром проявляется в виде кровоизлияний на коже и слизистых оболочках и различных кровотечений (носовых, желудочных, маточных, кишечных), часто повторяющихся и обильных.
   

   Нередко возникает поражение центральной нервной системы в виде менингитов и менингоэнцефалитов с резко выраженными оболочечными, а иногда и очаговыми симптомами, значительными изменениями в спинномозговой жидкости. Встречается и латентная форма лептоспирозного менингита, протекающая без оболочечных симптомов, с сильной головной болью, повторной рвотой и высоким уровнем лимфоцитарного плеоцитоза.
   

   Нарушение сердечно-сосудистой деятельности проявляется в понижении артериального давления, брадикардии, глухости сердечных тонов, систолическом шуме на верхушке, в изменениях на электрокардиограмме, свидетельствующих о диффузном повреждении миокарда. Расстройство гемодинамики, в ряде случаев, приводит к развитию острой сердечнососудистой недостаточности.
   

   Легочный синдром по клиническим и рентгенологическим данным выявляется у 9-12% больных и встречается чаще при иктерогеморрагическом лептоспирозе. Наблюдаются явления трахеита, бронхита. Пневмонии обычно мелкоочаговые и быстро разрешающиеся.
   

   При своевременной и адекватной терапии болезнь у большинства перенесших инфекцию заканчивается выздоровлением. Период выздоровления длителен.
   

   Восстановление функции поврежденные органов может растягиваться на месяцы.
   

   Началу периода выздоровление соответствует четвертая фаза болезни формирование нестерильного иммунитета. При наличии возбудителя в почках в крови появляются специфические антитела. В это время иногда развиваются различные осложнения: миокардиты, эндокардиты, ириты, иридоциклиты, увеиты, помутнение стекловидного тела, невриты периферических нервов, парезы, отиты и др.
   

   Патологоанатомические данные. Летальность при лептоспирозе завит от многих причин и колеблется от 5 до 48%. Непосредственной причиной смерти является инфекционно-токсический шок, острый почечно-печеночная или почечная недостаточность, острая сердечнососудистая недостаточность, выраженный геморрагический синдром.
   

   При патологоанатомическом исследовании умерших больных выявляется острая паренхиматозный гепатит с дискомплексацией печеночных балок; дистрофические изменения цитоплазмы эпителиальных клеток извитых канальцев; мелкоочаговый миокардит с выраженными дистрофическими изменениями кардиоцитов; продуктивный специфический) острый миозит икроножных мышц; дистрофические изменения нервных клеток ткани мозга, иногда с картиной серозного менингита. Геморрагический синдром проявляется в кровоизлияниях в кожу, ткань легких, в эпикард, в слизистую оболочку печеночных лоханок, твердую мозговую оболочку. Почти всегда прогрессирующая анемия, сопровождающаяся очаговой гиперплазией костного мозга.
   

   Морфологическая картина по всем органам характеризуется лимфогистиоцитарными воспалительными инфильтратами, что позволяет считать эти изменения специфическими для лептоспироза.
   

   Лабораторная диагностика. В целях лабораторной диагностики, результаты которой являются решающими для подтверждения лептоспирозной этиологии заболевания применяют различные методы:
   

   1) микроскопия;
   

   2) бактериологические исследования;
   

   3) биопробы на лабораторных животных;
   

   4) серологические исследования. Медицинские и ветеринарные работники для серологической диагностики лептоспироза среди людей и животных пользуются единым набором эталонных штаммов лептоспир.
   

   Микроскопия. Обнаружение лептоспир в нативных препаратах осуществляют с помощью конденсора «темное поле», осветителя ОИ-13 или ОИ-19 при увеличении в 280-400 раз или после окраски флюоресцирующим глобулином в люминесцентных микроскопах МЛ-1, МЛ-2, МЛ-З, МЛД.
   

   В «темном поле» микроскопа исследуют мочу, околосердечную жидкость, транссудаты из грудной и брюшной полостей, цитрированную кровь в нативном состоянии или в виде осадка после центрифугирования в течение 30 мин при 10-15 тыс. об/мин, суспензии из почек, легких, печени больных и павших сельскохозяйственных или экспериментально инфицированных лабораторных животных, которые предварительно отстаивают 30 мин при 4°С, центрифугируют 10 мин при 3 тыс. об/мин, отбирают для исследования надосадочный слой. Из каждого исследуемого материала на стеклах (не толще 1,1 мм) готовят не менее 10 препаратов «раздавленная капля», просматривают до 50 полей зрения для обнаружения морфологически характерных подвижных лептоспир.
   

   Иммунофлюоресцентные исследования проводят с использованием специфического флюоресцирующего глобулина. Сухой глобулин предварительно растворяют стерильной дистиллированной водой до указанного на этикетке ампулы первоначального объема. Растворенный глобулин дополнительно разводят физиологичен т раствором (рН 7,4-7,6) до рабочего разведения, также указанного на этикетке ампулы, переносят в стерильную пробирку, консервируют мертиолятом в соотношении 1:10000 (0,1 мл 1%-ного раствора мертиолята на 10 мл глобулина), закрывают резиновой пробкой и хранят (до 1 мес) при температуре 2-10°С. Рабочее разведение глобулина без консерванта можно использовать только в течение 5 дн. при условии хранения его при температуре 2-5°С.
   

   Исследуют кровь, паренхиматозные органы, транссудат из грудной и брюшной полостей перикардиальную и спинномозговую жидкость, мочу больных и павших животных, органы и ткани абортированного плода, из которых готовят мазки.
   

   Мазки высушивают при комнатной температуре, фиксируют ацетоном 5 мин. или этиловым спиртом 15 мин. и снова высушивают на воздухе. На каждый мазок наносят 3-5 капель рабочего разведения флюоресцирующего глобулина, выдерживают при комнатной температуре 20 мин., промывают водопроводной водой и физиологическим раствором (рН 7,4-7,6), затем дистиллированной водой. Мазки подсушивают на воздухе наносят на них небольшую каплю смеси, состоящей из 9 частей глицерина и 1 части 0,05 М фосфатного буфера (рН 8,0), накрывают покровным стеклом, просматривают в люминесцентном микроскопе. Для контроля готовят 2-3 мазка одного из диагностических штаммов лептоспир и окрашивают их параллельно с мазками из патологического материала.
   

   Окрашенные флюоресцирующим глобулином лептоспиры имеют зеленоватое, не сияющее, свечение всей поверхности микроба (в отличие от контурного сияющего свечения микробов других видов). В препарате лептоспиры сохраняют свою форму, просматриваются отдельные вторичные (первичные не видны) завитки спирали. Характерные для живых лептоспир булавовидные утолщения на концах, наблюдаемые при темнопольной микроскопии, не видны.
   

   Результаты люминесцентной микроскопии учитывают на основании обнаружения морфологически характерных лептоспир и интенсивности их свечения, оцениваемой в крестах:
   

   (++++)-четкое зеленоватое свечение; (+++)-умеренное зеленоватое свечение; (+)-зеленоватые «тени»; (-)-нет морфологически характерных форм для лептоспир.
   

   Диагноз на лептоспироз считают установленным при обнаружении в патологическом материале микробов с морфологией, типичной для лептоспир, с интенсивностью свечения не менее чем на два креста.
   

   Бактериологическое исследование
   

   В 5– 7 пробирок с питательной средой для лептоспир засевают по 3-5 капель из каждого патологического материала, в котором предварительной микроскопией обнаружены лептоспиры. Из почек, легких, печени посевы проводят пастеровской пипеткой, которой отбирают кусочки величиной с просяное зерно с поверхности органов после предварительного прижигания их шпателем. Посевы инкубируют при 26-28°С. Наличие роста выявляют микроскопией в «темном поле» раздавленных капель, которые готовят из всех пробирок начиная с 10 дня до 90 дня культивирования.
   

   Серогрупповую принадлежность выделенных лептоспир определяют в перекрестной РМА с групповыми агглютинирующими сыворотками, серовариантную - в реакции иммуноадсорбции или РМА с моноклинальными сыворотками. Групповые агглютинирующие лептоспирозные сыворотки выпускают в наборе к лептоспирам 13 серогрупп: Grippotyphosa, Pomona, Icte-rohaemorrhagiae, Canicola, Tarassovi, Bataviae, Hebdomadis, Australis, Autumnalis, Pyrogenes, Ballum, Cynopteri, Yavanica .
   

   Типируемую культуру 5-10-суточного роста, содержащую не менее 50 лептоспир в поле зрения микроскопа и не имеющую признаков агглютинации и лизиса, проверяют в РМАЛ с каждой из 13 групповых агглютинирующих сывороток. Перед постановкой реакции сыворотку растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке, а затем готовят двукратные разведения физиологическим раствором по схеме, представленной в табл. 20. Затем в лунках смешивают 0,1 мл типируемой культуры лептоспир с равным (0,1 мл) объемом каждого разведения сыворотки. После тщательного перемешивания пластины помещают на 1 ч в термостат при 37°С. Результаты РМА оценивают в «темном поле» микроскопа по четырех балльной системе: (++++) -агглютинированы и лизированы 100% лептоспир; (+++) -агглютинированы и лизированы 75% лептоспир; (++) -агглютинированы и лизированы 50% лептоспир; (+) -агглютинированы и лизированы 25% лептоспир; (-) -агглютинации лизиса нет.
   

   Испытуемую культуру относят к серологической группе лептоспир гомологичной наименованию сыворотки, с которой она дает реакцию на 2-4 креста до 50– 100% гомологичного титра.
   

   Выделение типичной культуры лептоспир из патологического материала дает основание для установления диагноза.
   

   Биологическое исследование
   

   Проводят для выделения и очистки культур лептоспир, определения их вирулентности. Патологический материал (моча, кровь, суспензия из органов от больных или погибших животных) вводят в брюшную полость двум 8-10-дневным крольчатам в дозе 2- 2,5 мл или двум 3-4-недельного возраста золотистым хомячкам в дозе 0,5-1 мл. При отсутствии гибели животных убивают: одно на 4-5-й день, другое на 15-16-и день после заражения. Из каждого органа и крови павших или убитых зверьков делают высевы в 3-4 пробирки с питательной средой для лептоспир. Одновременно микроскопически исследуют в «темном поле» препараты из транссудатов грудной и брюшной полостей, околосердечной сумки, мочи из мочевого пузыря, а также из почек, печени, легких обоих зверьков, а сыворотку крови животного, убитого через 14-16 дней после заражения, исследуют и в РМА. Микроскопическое обнаружение лептоспир в патологическом материале зараженных зверьков или положительная РМА в разведении их сыворотки 1:10 и выше дают основания для заключения о положительных результатах биопробы, и диагноз на лептоспироз считают установленным.
   

   Серологическое исследование
   

   Предусматривает постановку РМА и РА с сыворотками крови животных при подозрении на лептоспироз, а также для систематического контроля эпизоотической ситуации в племенных хозяйствах. С этой целью в племенных хозяйствах исследуют сыворотки крови всех производителей и не менее 10% по РМА и 15% по РА коров, нетелей, свиноматок и кобыл один раз в год; на племенных предприятиях (станциях, пунктах) искусственного осеменения всех производителей-2 раза в год; перед вводом и выводом для племенных целей в группах до 25 гол.-всех животных, до 100 гол.-не менее 25 животных, в больших группах-не менее 25% животных по РМА и 35% животных по РА. При постановке РМА сыворотку разводят физиологическим раствором 1:50, 1:250, 1:1250. Антигенами служат живые музейные культуры лептоспир 4-6-й серогрупп, которые постоянно выращивают в диагностических лабораториях. Реакцию ставят на плексигласовых пластинках. Разведенную сыворотку разливают по 0,1 мл в 3 лунки начиная с большего разведения. Каждую разведенную сыворотку разливают в отдельный ряд, число которых определяется количеством антигенов, используемых для постановки диагноза. Каждую культуру-антиген вносят по 0,1 мл в 3 лунки с разным разведением сыворотки. Затем пластины встряхивают и ставят в термостат на 1 ч при 37°С. Контролем служит смесь 0,1 мл каждой культуры-антигена с равным объемом физраствора.
   

   Реакцию учитывают посредством обнаружения склеивания лептоспир и образования «паучков» при микроскопии в «темном поле» капель из каждой лунки, которые исследуют от большего разведения к меньшему. Результаты реакции оценивают в крестах по пятибалльной системе (++++) -агглютнировано 100% лептоспир; (Ч-++) - агглютинировано 75% лептоспир; (++) -агглютинировано 50% лептоспир; (+) -агглютинировано 25% лептоспир; (-) -агглютинация отсутствует. Положительной считают реакцию, оцененную не менее чем на два креста при отсутствии агглютинации в контроле. При повторном исследовании сывороток крови реакцию ставят в тех же разведениях.
   

   Сыворотку крови от вакцинированных свиней и овец с диагностической целью можно исследовать на лептоспироз спустя 2 мес., а крупного рогатого скота-3 мес. после прививки.
   

   Диагноз на лептоспироз считают установленным при обнаружении нарастания титра антител у исследуемого животного в 5 и более раз при повторном исследовании сыворотки крови или при выявлении специфических антител в диагностических титрах более чем у 25% однократно обследуемых животных.
   

   Гистологическое исследование. Для гистологических исследований препараты окрашивают гематоксилин-эозином, для обнаружения лептоспир - методом импрегнации серебром по Левадити.
   

   При остром лептоспирозе гистологически изменения в печени характеризуются отечностью и разрыхлением волокон междольковой соединительной ткани, набуханием и десквамацией звездчатых эндотелиоцитов, наличием ареактивных некрозов, зернистой и жировой дистрофией печеночных клеток; в почках устанавливают зернистую дистрофию и гемосидероз эпителия извитых канальцев, пролиферацию эндотелия капилляров клубочков. При хроническом лептоспирозе и лептоспироносительстве выявляют в печени инфильтрацию интерстициальной ткани лимфоидными и гистиоцитарными клетками, иногда регистрируют мелкие очажки внутридольковых клеточных скоплений; в почках- пролиферацию лимфоидно-макрофагальных клеток с атрофией паренхиматозных элементов вокруг клубочков, в межканальцевой и особенно периваскулярной соединительной ткани, мукоидное и фибриноидное набухание стенок сосудов микроциркуляторного русла.
   

   Окраска препаратов по Левадити сводится к следующим этапам: фиксация в формалине при 37°С 10-20 мин; уплотнение в течение 3-5 ч в 95° алкоголя; промывание в проточной воде 10 мин, затем в дистиллированной воде 10- 15 мин; обработка 1,5%-ным раствором ляписа в течение 4-5ч при 50°; редукция в течение 4-10 ч при 50° в смеси следующего состава - пирогалловой кислоты - 2-4 г, 40%-ного формалина-5 мл и дистиллированной воды- 100 мл, ополаскивание в воде и заливка в парафин.
   

   Диагноз считают установленным при обнаружении лептоспир в гистологических препаратах почек или печени, импрегнированных серебром по Левадити.
   

   В результате перенесенного заболевания формируется продолжительный стерильный иммунитет с прекращением лептоспироносительства . Иммунитет носит группоспецифический характер и предохраняет от повторных заболеваний, вызываемых лептоспирами из одноименной с этиологическим агентом серогруппы. Например: человек, переболевший лептоспирозом Роmоnа, больше не заболеет при контакте с лептоспирами Роmоnа, но лептоспиры Icterohemorragiae могут вызывать повторное заболевание. Опасность развития злокачественного течения болезни требует обязательной госпитализации больных. Лечение лептоспироза должно быть комплексным и включать специфическую (противолептоспирозный иммуноглобулин), этиотропную (пенициллин, а при его непереносимости левомицетин-сукцинат) и патогененическую, направленную на детоксикацию и лечение осложнений, терапию. При отсутствии эффекта от проводимого лечения применяют плазмоферез, гемосорбцию, экстракорпоральный диализ.
   

Все известные бактерии по способности окрашиваться по методу Грама делятся на положительных и отрицательных. Это разделение зависит от особенностей строения и окраски их клеточной стенки.

Метод позволяет разделить все виды в зависимости от плотности строения наружной оболочки клетки микроорганизма на:

• более устойчивых к воздействию окружающей среды, влиянию антибиотиков;
• менее устойчивых.

Первым ученым, предположившим, что некоторые методы, ранее используемые только в ботанике, могут использоваться в микробиологии, был Роберт Кох.

В 1884 г. Кристиан Грам, датский биолог, специализирующийся на окраске тканей, впервые попробовал метод дифференцирующей окраски.

Открытие позволило разделить все существующие виды микроорганизмов на грамположительные и грамотрицательные, что послужило толчком для новой ступени развития науки в области микробиологических исследований. Это также дало возможность выявлять устойчивость патогенных видов к лекарственным препараты, предугадывать их поведение, а что самое главное – разрабатывать антибиотики нового поколения, способные победить болезнь.

Строение клеточной стенки

Оболочка любой бактерии состоит из специального вещества – муреина. Его молекула представляет собой цепи полисахаридов, расположенных параллельно. Полисахариды, в свою очередь, связаны между собой цепями аминокислот, расположенных перекрестно.

Данная связь обуславливает крепкость, упругость оболочки, ее способность держать форму. Своеобразная плетеная сетка является защитой внутреннего слоя микроорганизма от действия разрушающих факторов, препятствует попаданию внутрь воды. При этом просветы между цепочками позволяют клетке поглощать питательные вещества, словно поры.

У положительных по Граму микроорганизмов оболочка толще, прочнее, что обусловлено включением в ее состав белка.

У отрицательных видов строение клеточной оболочки значительно сложнее, что позволяет ей быть защищенной от действия таких сред, как слюна, желудочный сок, другие жидкости с содержащимся в них лизоцимом – ферментом, обладающим антибактериальными свойствами. Снаружи более тонкая оболочка окружена пленкой из липидов и полисахаридов – гладким поверхностным слоем.

Сущность метода Грама

Основой метода Грама является принцип разделения бактерий на микроорганизмы со знаками «плюс» и «минус» по Граму, основываясь на разном химическом составе клеточных стенок микроорганизмов.

Для определения грамположительных и грамотрицательных бактерий препарат, нанесенный на стекло тонким равномерным слоем, вначале фиксируют с помощью нагревания над горелкой. Затем окрашивают анилиновым красителем – метиловым фиолетовым. После чего фиксируют йодом, дают подсохнуть и смывают при помощи спирта.

• Грамположительные (Грам +) виды приобретают ярко-синюю окраску.
• Грамотрицательные (Грам –) бактерии обесцвечиваются.

Заключающим этапом является окрашивание препарата контрастным красителем красного цвета, который позволяет получить грамотрицательные микроорганизмы красного или розового цвета. Это обусловлено тем, что краситель не может проникнуть в клетку из-за толстого ее внешнего слоя, окрашивая только поверхность.

Мертвые микробы приобретают более яркую окраску, по сравнению с живыми.

Характеристика бактерий, положительных по Граму

Большинство грамположительных бактерий являются патогенными для человека. Это возбудители опасных заболеваний:

1. Стрептококк (Streptococcus), вызывающий тонзиллиты, фарингиты, ревматизм.
2. Стафилококк (Staphylococcus) – возбудитель заражения крови, кожных гнойных заболеваний.
3. Листерия (Listeria), вызывающая листериоз – воспаление мозга.
4. Бациллы (Bacillus) – возбудители токсикоинфекций, сибирской язвы.
5. Клостридии (Clostridium), вызывающие ботулизм, столбняк, газовую гангрену.

Два последних вида являются спорообразующими анаэробами, остальные не могут образовывать спор. Некоторые способны окрашиваться только в фазе активного роста.

Отрицательные бактерии по Граму

Это полностью обесцвечивающиеся после промывки спиртом бактерии; в результате повторной окраски сафранином приобретают розовый или ярко-красный цвет. Они более устойчивы к антителам, чем виды Грам +.

К грамотрицательным относятся в основном бактерии условно патогенные, способные вызвать воспалительные процессы и иммунный ответ в организме человека при определенных условиях. Их клеточная оболочка, состоящая из липополисахаридного слоя, вызывает синтез цитокинов, что способствует увеличению токсинов в месте локализации воспаления. Впоследствии токсины, разнесенные с кровотоком, отравляющим действием вызывают сильнейшие симптомы интоксикации.

Важная роль метода Грама в диагностике заболеваний

Метод, позволяющий отличить положительные бактерии по Граму и отрицательные, незаменим при исследовании человеческого биологического материала на выявление бактериальной инфекции.

Материал, используемый для диагностики:

• мокрота позволяет классифицировать состав микрофлоры носоглотки, обнаружив возбудителей заболеваний;
• в анализе кала обнаруживают токсины, вырабатываемые грамположительными видами;
• мазок из влагалища дает возможность посчитать процент грамотрицательных и положительных микробов для диагностики бактериальных вагинитов;
• плевральная, синовиальная, перинатальная жидкости также являются достаточно информативными.

Метод, внедренный Кристианом Грамом, позволил науке далеко продвинуться в знаниях о строении микробов, об их защитных механизмах. Он позволил ввести самую верную систему разделения бактерий на положительные и отрицательные, используемую до сих пор для диагностики инфекционных болезней.

Метод основан на способности микроорганизмов удерживать образующийся при окраске комплекс генцианового фиолетового и йода. Это связано с особенностями строения и химического состава грамположительных и грамотрицательных бактерий. У грамположительных бактерий на поверхности клеток есть магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, которые прочно связывают комплекс генцианового фиолетового с йодом и препятствуют его вымыванию спиртом. Кроме того, грамположительные бактерии имеют более выраженный пептидогликановый слой, в котором после обработки спиртом сужаются поры, что также делает невозможным вымывание красителя. В результате грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.

У грамотрицательных бактерий отсутствуют магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, пептидогликановый слой значительно тоньше, а размеры пор шире. Поэтому при обработке спиртом краситель легко вымывается, бактерии обесцвечиваются и при использовании дополнительного красного красителя грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Методика окраски по Граму

1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового на 1-2 минуты, затем краситель сливают.

2. Наносят раствор Люголя на 1 мин.

3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Препарат промывают водой.

5. Мазок докрашивают водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Этапы окраски по Граму представлены на стенде.

Конец работы -

Эта тема принадлежит разделу:

Изучение строения бактериальной клетки и структуры клеточной стенки

Студент должен иметь представление.. о механизмах окраски структурных компонентов бактерий клеточной стенки.. работа изучение строения бактериальной клетки и структуры клеточной стенки..

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ:

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Твитнуть

Все темы данного раздела:

Морфология прокариот. Методы выявления: окраска, микроскопия
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: изучить морфологию прокариот; особенности ультраструктуры бактерий, функции отдельных структур; ознакомиться с методами приготовления и окрас

Морфология прокариот
Цель:сравнить формы и размеры микроорганизмов на примере кишечной палочки, стафилококка и гриба кандиды (см. теоретическую справку). Самостоятельна

Морфология прокариот
Бактерии - это одноклеточные прокариоты растительного происхождения, но лишенные хлорофилла. Видны в световой микроскоп, размеры их измеряются в микрометрах. Размножение происходит

Техника приготовления препаратов-мазков, их фиксация и окраска
Для количественного учета, изучения морфологии, выявления спор, капсул, органоидов, включений препарат-мазок необходимо зафиксировать и окрасить. 1 этап. О

Методы окраски
Простые методы (ориентировочные) Сложные методы (дифференцирующие) 1. Применяют для изучения морфологии микроорганизмов. 2. Окрашивают одним кр

Окраска по Цилю-Нильсену
Применяют для дифференциации кислотоустойчивых и некислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость бактерий обусловлена повышенным содержанием в клеточной стенке и цитоплазме липидов,

Окраска по Ожешко
Метод основан на принципе окраски кислотоустойчивых бактерий. Отличие заключается в предварительной обработке микроорганизмов 0,5 % раствором соляной кислотой, что облегчает окраску спор карболовым

Окраска по Романовского-Гимза
Методика окраски по Романовскому-Гимзе: Краска Романовского-Гимза состоит из метиленового синего, эозина и азура. 1. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 ка

Самостоятельная работа во внеурочное время
1. Дайте определение: а) морфологические свойства - __________________________________________________ ____________________________________________________________________________

При обработке мазков (срезов) из органов и тканей, содержащих микроорганизмы, генцианвиолетом, а затем йодом, препарат, окрашенный в черный цвет, обладает свойством обесцвечиваться под действием спирта. При этом одни из содержащихся в мазке бактерий также обесцвечиваются, а другие окра­шиваются в фиолетовый цвет. При дополнительной окраске (в частности, фуксином Пфейффера) обесцвеченные спиртом бактерии окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные). Другие же, прочно удерживающие фиолетовую окраску (соединение йод + генцианвиолет), не обесцве­чивающиеся спиртом, относятся к группе грамположительных бактерий. Разница между грамположительными и грамотрицательными бактериями зависит от различия их изоэлектрических точек, а способность грамположительных бактерий удерживать окраску связана с присутствием в них магниевой соли рибонуклеиновой кислоты, которой грамотрицательные бактерии не содержат. Лучше всего окраска по Граму получается после фиксации мазков физическим методом (нагреванием). Особенности отношения тех или иных видов бактерий к разным краскам, в частности, к окраске по методу Грама, характеризуют так называемые тинкториальные свойства микробов.

Техника окраски. На фиксированный жаром мазок кладут полоску фильтровальной бумаги величиной немного короче и уже предметного стекла, наливают на нее достаточное количество раствора кристаллвиолета, карболового или же анилинового раствора генцианвиолета, или другой какой-либо фиолетовой трифенилметановой краски (напримep метилвиолета) на 1-2 минуты. Затем краску сливают, удаляют полоску фильтровальной бумаги и, не смывая водой, наливают на мазок раствор Люголя на 1-2 минуты. Раствор сливают и обесцвечивают препарат в 96° спирте в течение 30-60 секунд, промывают водой и окрашивают дополнительно фуксином Пфейффера (или разведенным сафра­нином, нейтральротом или везувином) в течение 2-3 минут. Затем краску смывают водой, а мазок высушивают чистой фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: при правильной окраске мазков по Граму грамположительные микробы будут окрашены в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в цвет дополнительной краски (например, в розовый цвет фуксина Пфейффера).

Нельзя пользоваться загрязненной фильтровальной бумагой: возможен механический перенос микробов с одного мазка на другой, что может отра­зиться на результатах микроскопии. Продолжительность воздействия краской, раствором Люголя (протравой) и спиртом зависит от толщины мазка. Особенно ответственным моментом в окраске по Граму является обесцвечивание мазка спиртом. При коротком воздействии спирта получаются перекрашенные препараты, а при длительном все микробы (в том числе и rpaмположительные) обесцветятся. На густой, толстый мазок (например, из агаровой культуры) время воздействия спиртом должно быть большим, нежели на тонкий мазок, особенно с жидких культур. При воздействии спиртом на неравномерно приготовленный мазок в толстых его частях микробы оста­лся необесцвеченными, а в тонких обесцветятся; получится «пестрая» картина окраски, что может привести к неправильным выводам.

Иногда в культуре грамположительных бактерий могут наблюдаться грамотрицательные особи, которых тем больше, чем старше популяция. Это ничто иное, как бактериальные трупы, претерпевшие внутриклеточный автолиз, в результате которого клетка лишилась рибонуклеинатов магния. С другой стороны, в очень молодых культурах (несколько часов роста) из семейства энтеробактерий гигантские, юные формы этих бактерий, которые в 2-3 раза крупнее взрослых особей (18-часовых), очень базофильны вследствие перегрузки их цитоплазмы рибонуклеинатами. Поэтому при окраске по Граму они окрашиваются фуксином так интенсивно, что при плохом освещении их можно принять за грамположительные вегетативные формы спороносных палочек.

Для начинающих, а также в сомнительных случаях, рекомендуется на том же стекле, где находится исследуемый мазок, приготовить по сторонам кон­трольные препараты - один из культуры микробов, заведомо грамположительных, а другой - из грамотрицательных.

При обесцвечивании препарата в окраске по Граму спирт можно нали­вать непосредственно на мазок, постоянно покачивая стекло. Лучше же обесцвечивание проводить в кюветках, куда наливают спирт и, захватив пинцетом Корнэ препарат, поднимают и опускают его, следя за цветом сте­кающего со стекла спирта. Обесцвечивание считается законченным, когда стекающие с мазка капли спирта сравняются по цвету со спиртом в кюветке; обычно для этого требуется 10-30 секунд, в зависимости от толщины мазка.

Спирт 96° в кюветках следует чаще сменять (80° спирт уже неправильно дифференцирует мазок). Отработанный спирт обычно сливают из кюветок в спиртовые горелки.

Для начинающих можно рекомендовать обесцвечивание мазков йодированным спиртом. Установлено, что если к обесцвечивающей жидкости добавить немного йодной настойки, то микробы, окрашивающиеся грамположительно, не обесцвечиваются в такой жидкости даже в течение часа, а грамотрицательные раскрашиваются приблизительно в 5 секунд. По дан­ным Саватеева, достаточно добавить 2-4 мл 10% йодной настойки на 100 мл 95° спирта; раствор может сохраняться долгое время. В том случае, если вместо спирта используют ацетон, йодную настойку прибавляют перед использованием.

Для обесцвечивания мазков йодированным спиртом достаточно двух минут, после чего следует промывка водой и дополнитель­ная окраска фуксином Пфейффера.

studfiles.net

Мир науки

Окраска по Граму – основной метод окраски в бактериологии. С окраски по Граму начинается описание морфологических свойств. Такое значение этого метода обуславливается тем, что окраска бактериальной клетки по Граму зависит от типа строения её клеточной стенки и, соответственно, принадлежности к отделу Firmicutes или Gracilicutes – первого этапа идентификации любого вида в бактериологии. Окраска по Граму осуществляется в четыре этапа.А. На первом этапе фиксированный мазок окрашивается генциановым фиолетовым.

1. Окрашивание продолжается 1 – 2 минуты.2. И грамположительные и грамотрицательные бактерии окрашиваются этой краской в синий цвет.Б. На втором этапе мазок обрабатывается раствором Люголя, который формирует с генцианвиолетом красящий комплекс, локализующийся на цитоплазматической мембране.1. Обработка раствором Люголя продолжается 1 – 2 минуты.2. И грамположительные и грамотрицательные бактерии на этом этапе остаются синими.В. На третьем этапе мазок обесцвечивается спиртом.1. Обесцвечивание спиртом продолжается примерно 20 секунд с последующим обильным промыванием водой.2. Грамположительные бактерии за это время не успевают обесцветиться и остаются синими, а грамотрицательные, вследствие более тонкого слоя пептидогликана, препятствующего вымыванию спиртом красящего комплекса, обесцветиться успеют и, следовательно, станут бесцветными.Г. На четвертом этапе мазок окрашивается водным фуксином или другой красной краской – сафранином.1. Докраска красной краской продолжается 1 – 2 минуты. Причем, этот этап лучше продлить подоль-ше, так как после обесцвечивания бактериальная клеточная стенка воспринимает краску хуже, чем обычно.2. Грамположительные бактерии остаются синими, так как они уже окрашены более темной краской а грамотрицательные, которые на предыдущем этапе обесцветились, на этом этапе окрашиваются в красный цвет. Д. Грамположительные бактерии составляют меньшую часть тех бактерий, которые изучает меди-цинская микробиология. Ниже приводятся основные (этот перечень будет позже добавлен неспорооб-разующими анаэробами).1. Грамположительными являются большинство кокков (кроме нейссерий): стафилококки, стрепто-кокки и пневмококки, энтерококки.2. Среди палочек грамположительными являются листерии, бактерии актиномицетного ряда (актино-мицеты, микобактерии, коринебактерии), спорообразующие палочки (бациллы и клостридии).Е. Большинство бактерий, имеющих медицинское значение, грамотрицательные. Лишь по отношению к микоплазмам не корректно говорить об их грамотрицательности (хотя по Граму они окрашивались бы в розовый цвет – если бы их так окрашивали, так как на практике этот метод в изучении микоплазм не применяется). Дело в том, что грамоложительные и грамотрицательные бактерии отлича-ются друг от друга типом клеточной стенки (прежде всего – количеством содержащегося в ней пепти-догликана), а у микоплазм клеточной стенки с содержанием пептидогликана нет.1. Из кокков грамотрицательные – нейссерии.2. Грамотрицательными являются большинство палочек (собственно все, за исключением перечисленных выше грамположительных).

3. Клеточную стенку грамотрицательного типа имеют также спирохеты.

Page 2

Основной функцией белков главного комплекса гистосовместимости является представление антигенных пептидов в такой форме, в которой их могут распознать рецепторы Т-клеток. Как именно антигенный пептиды попадают в

Подробнее: Процессинг и презентация антигена

Содержимое клеток можно извлечь, растирая ткань между вращающимися стеклянными поверхностями (гомогенизация) или при помощи различных химических методов, разрывая плазматическую мембрану.

Подробнее: Органеллы клеток - биология

Плазмалемма не только образует барьер между вне- и внутриклеточном жидкостями, но и участвует в межклеточных взаимодействиях, формирующих ткани организма. Некоторые клетки, например в крови, не связаны друге другом, а плавают в жидкости (плазме и г. и).

Подробнее: Межклеточные контакты - биология

worldofscience.ru

Исследование морфологических свойств микробов

Приготовление фиксированного препарата и окраска его по Граму

А. Приготовление фиксированного препарата.

Препараты бактерий готовят на предметных стеклах, которые должны иметь толщину, не превышающую 1,2-1,4 мм. Поверхность стекла должна быть тщательно очищена и обезжирена. В повседневной работе достаточно натереть сухое чистое стекло сухим хозяйственным мылом, после чего тщательно протереть сухой хлопчатобумажной салфеткой; на хорошо обезжиренном стекле капля воды равномерно расплывется (не сохраняет каплевидную форму).

На обезжиренное предметное стекло наносят небольшую каплю водопроводной воды и переносят в неё профламбированной (стерильной) биологической петлей незначительное количество исследуемого материала. Биомассу бактерий вращательным движением петли растирают в капле воды на площади примерно 4 см 2. Слой должен быть настолько тонким, что мазок высыхает почти сразу после приготовления.

Высушивание мазка следует проводить при комнатной температуре на воздухе. Если оно замедлено, то препарат можно слегка нагреть в токе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить крайне осторожно, не перегревая препарат, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

Фиксация мазка преследует несколько целей: убить микроорганизмы, приклеить их к стеклу, обеспечить лучшее окрашивание. Для того, чтобы зафиксировать мазок, нужно три раза провести предметное стекло через самую горячую часть пламени горелки, держа его мазком вверх.

Б. Окраска препарата по Граму.

На зафиксированный мазок помещают фильтровальную бумажку и наносят краситель генцианвиолет на 1,5-2 мин. (на этой стадии операции необходимо следить, чтобы краситель проходил на мазок через фильтр). Далее фильтровальную бумагу убирают и наносят на мазок раствор Люголя также на 1,5-2 мин. Раствор Люголя сливают и обрабатывают мазок 96%-м этиловым спиртом в течение 30 сек. Затем мазок промывают водой, докрашивают фуксином Циля (1,5-2 мин.) и промывают водой до «светлой капли». Далее мазок высушивают, наносят на него иммерсионное масло и изучают в микроскопе при увеличении объектива 90х.

Методы исследования живых клеток

А. Препарат «раздавленная капля»

На обезжиренное предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и помещают в неё небольшое количество культуры изучаемых микроорганизмов. Взвесь бактерий размешивают и прикрывают покровным стеклом. Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, чтобы после прижимания её покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под него. В противном случае избыток жидкости необходимо удалить фильтровальной бумагой, которую затем следует сразу опустить в дезинфицирующий раствор.

Б. Препарат «висячая капля».

Каплю суспензии микроорганизмов биологической петлей наносят на покровное стекло, которое затем переворачивают каплей вниз и помещают над лункой специального предметного стекла (стекло с лункой). Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином для герметизации камеры.

В. Препарат «отпечаток»

Из агаризованной среды, на которой микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его на предметное стекло таким образом, чтобы поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или к колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат (покровное стекло) помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего на предметное стекло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии предметным стеклом.

Препараты живых клеток рассматривают с «сухими системами» микроскопа. После микроскопирования такие препараты перед мытьем должны быть выдержаны в дезрастворе.

Цитохимические методы исследования строения микробов

А. Окраска капсул и приготовление красителей

а) Окраска капсул

Для окраски капсул применяют методы Михина, Ольта, Ребигера, Романовского-Гимза, Гинса, негативный метод Бурри.

Метод Михина. Фиксированный мазок окрашивают синькой Леффлёра в течение 2-3 мин. при подогревании (до появления паров), после чего краску быстро смывают водой и мазок высушивают между листами фильтровальной бумаги. Клетка окрашивается в темно-синий цвет, капсула - в светло-розовый.

Метод Ольта. Фиксированный препарат окрашивают 2-3%-м водным раствором сафраина в течение 1-3 минут (лучше при подогревании) и быстро промывают водой. Раствор сафраина готовят перед употреблением, растворяя краску в воде, доведенной до кипения, затем фильтруют через бумажный фильтр. Клетки окрашиваются в красно-коричневый цвет, капсулы - в бледно-желтый.

Метод Ребигера. Окрашивают и фиксируют препарат одновременно формалиновым раствором генцианвиолета. Нефиксированные мазки окрашивают 15-20 сек., быстро промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Клетки окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, капсулы - в красновато-фиолетовый.

Метод Романовского-Гимза. Краску фабричного приготовления перед окрашиванием мазков растворяют из расчета одна капля краски на 1 мл дистиллированной воды. Разведенную краску наливают на дно чашки Петри, в которую кладут две тонкие стеклянные палочки или спички. Мазок, зафиксированный метиленовым спиртом, помещают в чашку до соприкосновения с краской (бактерии находятся на нижней плоскости мазка). Окрашивание проводят 30-40 минут. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе в вертикальном положении. Клетки окрашиваются в сине-фиолетовый, а капсулы - в красно-фиолетовый цвета.

Негативный метод Бурри. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю туши, разведенную в 10 раз дистиллированной водой. В тушь вносят каплю исследуемой культуры и хорошо смешивают. Полученную взвесь другим стеклом равномерно распределяют по поверхности предметного стекла, высушивают на воздухе. Препарат рассматривают с иммерсией. На темно-дымчатом фоне хорошо видны неокрашенные капсулы и клетки бактерии.

Метод Гинса. На край предметного стекла наносят каплю туши, вносят в неё клетки, хорошо перемешивают и ребром другого стекла делают мазок по всей поверхности стекла. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют 5-10 минут жидкостью Никифорова или 3 минуты абсолютным метанолом. Далее мазок окрашивается фуксином Циля, разбавленным водой в соотношении 1:3. Время окрашивания 2-3 мин. Препарат промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсией. На темно-сером фоне выделяются розово-малиновые клетки, окруженные бесцветными капсулами.

Окраска капсул бактерий по Муромцеву. На фиксированный мазок наносят краситель Муромцева на 30-40 сек., мазок промывают, высушивают, микроскопируют с иммерсией. Микроскопическая картина - капсулы розовые, бактерии - темно-синие.

б) Приготовление красителей для окраски капсул.

Синька Леффлера. Насыщенный спиртовой раствор метиленовой сини: 1,6 г метиленового синего растворяют в 100 мл 95%-го этилового спирта.

30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего смешивают со 100 мл 0,01%-го раствора КОН.

Раствор КОН: 0,01 г КОН развести в 99,99 мл дист. воды.

Раствор сафраина. 3 г сафраина смешать с 97 мл дистиллированной воды, довести до кипения, профильтровать. Краска готовится перед употреблением.

Формалиновый раствор генцианвиолета. 15-20 г генцианвиолета растворить в 100 мл 40%-го формалина, оставить на 6-8 часов при комнатной температуре, профильтровать, после чего он готов к употреблению.

Краситель Романовского-Гимза. Готовый реактив разводят перед употреблением: 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды.

Смесь Никифорова. Этиловый спирт и серный эфир в равных объемах.

Комбинированная краска по Муромцеву. Первый раствор - фуксин основной - 0,15 г, спирт этиловый 96%-й - 20 мл, карболовая кислота кристаллическая (фенол) - 10 г. Второй раствор - метиленовый голубой - 2,5 г, вода дистиллированная - 200 мл. Оба раствора смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

Б. Определение кислотоустойчивости бактерий.

Кислотоустойчивость - свойство, характерное для некоторых микобактерий и нокардий. Оно заключается в сохранении окраски клетками этих бактерий при обработке их кислотой. Кислотоустойчивость связана с особенностью химического состава клеточной стенки этих бактерий: в ней содержится много сложных липидов и миколовых кислот.

На обезжиренном предметном стекле готовят два мазка: исследуемых клеток и клеток кислотоустойчивых микобактерий. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют в пламени горелки. На препарат помещают фильтровальную бумагу и заливают карболовым фуксином Циля и затем 2-3 раза подогревают его до появления паров, держа стекло высоко над пламенем горелки. За появлением паров наблюдают, глядя на мазок сбоку; при их появлении тотчас отставляют препарат в сторону. После этого препарату дают остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и мазок промывают водой. Затем препарат обесцвечивают 5%-ой серной кислотой. Для этого предметное стекло 2-3 раза погружают в стакан с кислотой, не задерживая его в ней. Препарат вновь тщательно промывают водой и докрашивают 3-5 минут синькой Леффлера. Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают и исследуют с иммерсией. Кислотоустойчивые клетки приобретают красный цвет, тогда как некислотоустойчивые - синий. Кислотоустойчивость можно определять у клеток любого возраста.

Реактивы для определения кислотоустойчивости.

Фуксин Циля. 5 %-й раствор свежеперегнанного фенола 100%, насыщенный спиртовой раствор фуксина основного - 10 мл. Приготовленную смесь отфильтровывают через 48 часов. Краситель устойчив при хранении.

Другой способ получения фуксина Циля: фуксин основной - 1 г, фенол кристаллический - 5 г, спирт 96 %-й - 10 мл, глицерин - несколько капель, вода дистиллированная - 100 мл. Основной фуксин растворяют в этаноле, затем добавляют растворенный в воде фенол. Раствор перемешивают и оставляют на несколько дней. Перед использованием его фильтруют.

В. Окраска спор и приготовление реактивов.

а) Окраска спор

Споры по сравнению с цитоплазмой характеризуются более высоким показателем преломления света, поэтому при микроскопировании в светлом поле они видны как более темные включения округлой или овальной формы. При использовании фазово-контрастного устройства споры имеют вид светлых включений на фоне почти черных клеток.

Эндоспоры обладают многослойными труднопроницаемыми оболочками, поэтому при простой обработке препарата спорообразующих бактерий фуксином или генцианвиолетом споры не окрашиваются. При микроскопировании они обнаруживаются в клетке в виде бесцветных включений. Свободные споры имеют вид колец.

Метод Пешкова. Мазок готовят на обезжиренном предметном стекле, высушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки и заливают раствором метиленовой сини по Леффлёру. Краситель доводят до кипения, держа стекло над пламенем горелки. По мере испарения красителя добавляют новые его порции. Продолжительность окраски, считая с момента закипания, - 10-20 сек. Затем предметное стекло охлаждают, тщательно промывают водой и докрашивают в течение 30 сек. 0,5%-м водным раствором нейтрального красного или сафраина. Краситель сливают, мазок промывают водой и просматривают с иммерсионной системой. При правильном окрашивании клетки имеют красный, а споры - синий цвет. Вместо метиленового синего можно использовать другой краситель - малахитовый зеленый. В этом случае фиксированный препарат заливают на 7-10 минут 7,5%-м раствором малахитового зеленого. Окрашивание проводят с подогревом, помещая препарат над сосудом с кипящей водой или над пламенем горелки. По окончании окраски предметное стекло охлаждают и докрашивают 0,25%-м водным раствором сафраина в течение 1-2 минут. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетки - в розовый.

Метод Циля - Нильсена в модификации Мюллера. На фиксированный над пламенем мазок наливают 5%-й водный раствор хромовой кислоты, которую через 5-10 минут смывают водой. Препарат накрывают полоской фильтровальной бумаги и обильно смачивают карболовым фуксином Циля. Подогревают препарат над пламенем до появления паров, но не до кипения, потом отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя (так в течение 7 минут). При этом важно, чтобы краситель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения мазка её снимают, препарат промывают водой и тщательно промокают фильтровальной бумагой. В результате такой обработки клетки со спорами равномерно прокрашиваются. Поэтому для обесцвечивания цитоплазмы препарат затем обрабатывают 1%-м раствором соляной или серной кислоты в течение 15-30 секунд. При превышении этого времени может обесцветиться и спора. Затем препарат промывают водой и докрашивают метиленовым синим 2 мин. Если все операции проделаны правильно, окраска получиться контрастной и споры ярко-красного цвета будут четко выделяться на голубом фоне цитоплазмы.

б) Реактивы для окрашивания спор бактерий

1. Карболовый фуксин Циля (см. выше).

2. Метиленовый синий Леффлёра (см. выше).

3. Насыщенный водный раствор метиленового синего: 2 г красителя растворить в 100 мл дистиллированной воды.

4. Хромовая кислота, 5%-й раствор.

5. Кислота соляная или серная, 1%-й раствор.

6. Сафраин, водный раствор: 2,5%-й раствор сафраина в 96%-м этаноле - 10 мл, вода дистиллированная - 100 мл.

7. Малахитовый зеленый: малахитгрюн - 7,5 г, вода дистиллированная - 92,5 мл.

8. Метиленовый синий насыщенный спиртовой раствор: метиленовый синий - 3 г, 96%-й спирт - 100 мл. Раствор оставляют на 2-3 дня, несколько раз перемешивают, потом фильтруют. Раствор устойчив.

9. Метиленовый синий по Леффлёру (другой рецепт): 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего растворить в 100 мл дистиллированной воды, добавить 1 мл 1%-го водного раствора КОН.

Г. Окраска жгутиков

а) Приготовление препарата

Отдельный бактериальный жгутик настолько тонок, что неразличим в световом микроскопе, если он не окрашен особым способом, который увеличивает толщину жгутиков. Существует несколько способов окраски жгутиков. Все они основаны на использовании различных протрав, осаждающихся на поверхности жгутиков, благодаря чему диаметр жгутиков увеличивается в диаметре и они становятся видимыми в световом микроскопе. Окраска жгутиков требует тщательной подготовки культуры и аккуратности в работе, так как жгутики легко обламываются даже при легком взбалтывании культуры.

Для подготовки культуры рекомендуется ежедневно несколько дней подряд делать пересевы культуры на свежую питательную среду в жидкую среду или в конденсационную воду свежей скошенной агаризованной среды. Кроме того, в день просмотра можно брать петлей материал и переносить в пробирку с 5-6 мл стерильной водопроводной воды, нагретой до 37°С. Не рекомендуется болтать петлей в воде, бактериальная масса сама должна в течение 30-60 мин разойтись в ней.

Прежде чем приступить к работе, необходимо проверить подвижность клеток в висячей капле. В случае отсутствия подвижности пробирку оставляют в термостате на 1,5-2 суток.

Для приготовления препаратов необходимы совершенно чистые предметные стекла. Их кипятят в растворе бихромата калия в крепкой серной кислоте, затем дважды промывают в растворе едкого натра. После этого стекла промывают водой и хранят в банке с 96%-м спиртом. Пред приготовлением мазка следует сильно нагреть ту сторону стекла, на которую будет нанесен мазок, но наносить его надо на охлажденное стекло.

б) Методы окрашивания.

Метод Леффлёра. Суспензию бактерий наносят на стекло пастеровской пипеткой или петлей (3-4 маленьких капли) и сушат при комнатной температуре. Допускается фиксация мазка быстрым одноразовым проведением через пламя. Далее препарат заливают протравой на 3-5 минут при нагревании до появления паров или 15-20 минут при комнатной температуре, потом промывают сильной струей дистиллированной воды 30 сек. и высушивают на воздухе. Окрашивают препарат карболовым фуксином Циля 3-4 минуты при легком нагревании до появления пара (фуксин содержит 1 часть насыщенного спиртового раствора фуксина и 10 частей воды, или в соотношении 1:1). Затем препарат промывают водой и исследуют с иммерсией. Жгутики и клетки бактерий окрашиваются в розовый цвет.

Метод Фонтана. В пробирку с 0,5 мл стерильной водопроводной воды вносят клетки, взятые на границе с конденсационной водой. Материал берут осторожно, слегка касаясь культуры, а не вести биологической петлей по поверхности агара. Петлю с бактериальной массой оставляют в воде на 1 час. За это время подвижные бактерии окажутся свободно взвешенными в воде. Затем петлю вынимают, прокаливают, охлаждают и только после этого ею берут капли взвеси бактерий и осторожно наносят на обезжиренное предметное стекло. Нанесенные капли не размазывают, они должны быстро высохнуть, лучше в термостате. Мазки фиксируют 5 минут жидкостью Руге. Препарат промывают водой, заливают протравой (см. ниже) и подогревают стекло до появления паров в течение 2 минут. Протраву сливают, препарат тщательно промывают водой. Далее обработку препарата проводят серебрением: разбавленный аммиачный раствор серебра наливают на мазок и стекло несколько раз осторожно подогревают в течение 2-х минут до появления паров. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией. Бактерии в препарате окрашены в черный или темно-коричневый цвет, а жгутики (часто спутанные) - в светло-коричневый или желтый.

Метод серебрения жгутиков по Морозову. Препарат готовится, как описано выше. На препарат наливают на 1 минуту реактив №1. Затем его сливают, промывают водой и наливают реактив №2. Подогревают на слабом пламени до появления паров, тщательно промывают водой и 1-2 минуты (при подогревании) обрабатывают препарат реактивом №3 до появления темно-коричневой окраски мазка. Мазок тщательно промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией.

в) Реактивы для окраски жгутиков.

Приготовление протравы: 12 г танина растворяют при нагревании в 48 мл воды, добавляют 30 мл насыщенного раствора железного купороса FeSO4 и 6 мл насыщенного раствора фуксина в 96%-м спирте. Смесь готовят за несколько дней до употребления, хранят в склянке с притертой пробкой в темном месте. Перед употреблением фильтруют.

Краситель: карболовый фуксин Циля и дистиллированная вода в соотношении 1:1. Готовят перед употреблением и фильтруют.

Реактив №1: 1 мл ледяной уксусной кислоты, 20 мл формалина 40%-го, 100 мл дистиллированной воды. Это жидкость Руге.

Реактив №2: протрава - танин (5 г), фенол кристаллический (1 г) и дистиллированная вода (100 мл).

Реактив №3 (реактив для серебрения): азотнокислое серебро - 5 г, раствор аммиака, вода дистиллированная - 100 мл. К 3-4 мл 5%-го раствора азотнокислого серебра по каплям прибавляют раствор аммиака до помутнения и образования осадка, а затем осторожно до растворения осадка. После этого вновь прибавляют раствор серебра до появления легкой опалесценции. Полученный раствор аммиачного серебра разводят дистиллированной водой в 10 раз.

Д. Окраска включений клеток микроорганизмов

Окраска гликогена. Гликоген - животный крахмал часто накапливается в клетках дрожжей, бацилл. Для выявления гликогена к капле суспензии клеток на предметном стекле добавляют каплю раствора Люголя. Препарат покрывают покровным стеклом и микроскопируют гранулы гликогеноподобных веществ, окрашенные в красновато-коричневый цвет.

Окраска гранулёзы. Гранулеза - крахмалоподобное вещество. Гранулеза в больших количествах накапливается в клетках маслянокислых бактерий. Анализ проводят аналогично выявлению гликогена. Гранулеза окрашивается в синий цвет.

Окраска жира. Жир содержится в клетках почти всех микроорганизмов, особенно много его накапливается при старении культуры.

На предметное стекло наносят небольшую каплю 40%-го раствора формалина. Петлей в каплю вносят культуру микроба. Формалин убивает клетку и разрыхляет оболочку. Через 5 минут добавляют каплю метиленового синего и спустя 10 минут каплю судана III - индикатора жироподобных веществ. Образовавшуюся общую каплю накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсией. Цитоплазма клеток окрашиваются в синий цвет, включения жира - в розово-оранжевый.

Бактерии в качестве резервных липидов образуют гранулы поли-бета-оксимасляной кислоты. Для их выявления готовят фиксированный мазок, окрашивают суданом черным или суданом III в течение 5-15 минут (краситель при этом может высохнуть, но это не имеет значения). Затем краситель смывают, препарат подсушивают фильтровальной бумагой и обрабатывают ксилолом, несколько раз погружая в него препарат. Время просветления препарата в ксилоле не должно превышать 1 минуту. После этого клетки дополнительно окрашивают 0,5%-м раствором сафранина в течение 5-10 сек. Включения поли-бета-оксимасляной кислоты выглядят как черно-синие гранулы в розовой цитоплазме клеток.

Окраска полифосфатов (волютин, метахроматин). На тонкий, зафиксированный на горелке мазок, наносят метиленовую синь по Леффлеру и окрашивают в течение 10 минут. Краситель сливают, промывают, просушивают, микроскопируют с иммерсией. Клетки окрашиваются в голубой цвет, а зерна волютин - в фиолетово-красный.

Окраска волютина по Омелянскому. На фиксированный в пламени мазок наносят фуксин Циля и окрашивают клетки 0,5-1 минуту. Промывают препарат водой и обесцвечивают 1%-м раствором серной кислоты в течение 20-30 сек. Кислоту сливают, мазок промывают водой и дополнительно докрашивают метиленовым синим (в разведении 1:40) 20-30 сек. Препарат вновь промывают, высушивают, микроскопируют с иммерсией. При правильном окрашивании гранулы волютина имеют красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы.

Окраска волютина по Муромцеву. Тонкий фиксированный смазок культуры микроба окрашивают краской по Муромцеву 1 минуту. Мазок промывают водой, сушат и микроскопируют с иммерсией. Зёрна волютина окрашиваются в фиолетовый цвет, цитоплазма - в голубой.

Препараты для окрашивания включений.

1. Раствор Люголя для выявления гликогена и гранулезы: йод кристаллический - 1 г, калий йодистый - 3 г, вода дистиллированная - 300 мл.

2. Судан III - 0,5 г, молочная кислота концентрированная - 100 мл.

2-а. 0,1 г судана III растворяют в 200 мл 96%-го спирта или концентрированной молочной кислоты.

3. Судан черный В - 0,3 г, 100 мл 70%-го горячего этилового спирта. Раствор выдерживают несколько часов в закупоренной склянке при 60°С, затем охлаждают и фильтруют.

4. Метиленовый синий 1:40. Насыщенный спиртовой раствор метиленового синего - 1 мл, вода дистиллированная - 40 мл.

Е. Выявление нуклеоида и приготовление реактивов

а) Методы выявления

Метод Романовского-Гимза. Препарат фиксируют метиловым спиртом или фиксатором Карнуа. В последнем случае для удаления следов уксусной кислоты препарат промывают этиловым спиртом и тщательно высушивают на воздухе. Окрашивают препарат красителем Романовского-Гимза в течение суток, затем ополаскивают слабощелочной водой (pH 7,2), высушивают и микроскопируют с иммерсией. Ядерные вещества окрашиваются в красно-фиолетовый цвет, цитоплазма - в слабо-розовый.

Реакция Фельгена. Препарат обрабатывают фиксатором Карнуа в течение 5 мин., промывают абсолютным спиртом, гидролизуют 7 минут в растворе 1н. соляной кислоты, подогретой до 60°С, погружают на 1-2 минуты в холодную 1н. соляную кислоту и переносят в фуксинсернистую кислоту (реактив Шиффа) на 3-4 часа. Препараты последовательно промывают в трех кюветах с сернистой водой по 20 минут в каждой, затем споласкивают дистиллированной водой, высушивают и микроскопируют. Ядерное вещество окрашивается в фиолетовый цвет.

Модификация метода Фельгена. После гидролиза в соляной кислоте препарат немедленно промывают водой и помещают на 15 минут в 1%-й раствор формалина. Вновь промывают водой и окрашивают в течение 1-2 минут 0,1-1%-м водным раствором основного фуксина. Препарат промывают, высушивают, исследуют с иммерсией. Цитоплазма окрашивается в розовый цвет, нуклеоид - в ярко-малиновый.

б) Реактивы для выявления нуклеоида.

1. Фиксатор Карнуа: 96%-й этиловый спирт - 60 мл, хлороформ - 30 мл, ледяная уксусная кислота - 10 мл (время фиксации - 15 минут).

2. Краситель Романовского-Гимза: состоит из смеси азура, эозина и метиленового синего. Перед употреблением к 10 мл красителя добавляют 10 мл дистиллированной воды (pH 7,2).

3. 1н. соляная кислота.



biofile.ru

5Окраска по Граму. Методика:

окрасить мазок генцианвиолетом (2 минуты,через фильтровальную бумагу);

бумагу удалить, оставшуюся краску слить;

окрасить мазок раствором Люголя (1 минута);

раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (30-40 секунд, осторожно покачивать стекло);

тщательно смыть спирт водой;

окрасить водным фуксином (2 минуты);

промыть водой и высушить.

Грам-положительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, Грам-отрицательные – вкрасный Окраска кислотоустойчивых бактерий. Кислотоустойчивые микроорганизмы обладают выраженной к неорганическим кислотам, спиртам, щелочам. Это связано с наличием в клеточной стенке и мембране сравнительно большого количества липидов. Бактерии этой группы очень плохо окрашиваются обычными способами, поэтому используют концентрированные растворы с подогревом. При последующей кратковременной обработке кислотой клетки, воспринявшие краску, не обесцвечиваются. Это позволяет отличить кислотоустойчивые бактерии. Их окрашивают по методу Циля-Нильсена, который разработан с учетом все указанных особенностей Окраска по Цилю-Нильсену. Методика:

нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок. Покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 минут);

бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 3% серной кислотой или 3% солянокислым спиртом (3-4 секунды);

тщательно промыть водой;

окрасить дефферовской синькой (3-5 минут);

промыть водой и высушить.

Окаска спор. Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за низкой проницаемости стенки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспринимается только вегетативной частью микроба, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее клетки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при испольщовании концентрированного раствора краски в подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немедленно отдают краску. Метод Ожешко.

нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 минуты);

слить кислоту, промыть водой, высушить;

зафиксировать в пламени;

окрасить по методу Циля-Нильсена (при этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий). Часто для окраски спор используют только метод Циля-Нильсена.

Окраска включения волютина (по Нейссеру).

Окрасить мазок уксуснокислой синькой Нейссера (2-3 минуты);

• Окрасить раствором Люголя (30 секунд);

  Слить раствор Люголя и окрасить везувином (1 минута)

  Промыть препарат и высушить

Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, принимает желтый цвет. Зерна волютина – темно-синие, почти черные. Окраска по Бурри (обнаружение капсул).

Для обнаружения капсул используют негативную окраску, т.к. окрашивается пространство между бактериями. Таким образом, образуется темное поле с не окрашенными бактериями.

Смешать на предметном стелке немного капсульной культуры и каплю разведенной (1:9) туши;

Высушить на воздухе и бактериоскопировать.

Модификация по Бурри-Гинсу включает создание фона краской конгорот, последующую фиксацию в 5% растворе соляной кислоты, дополнительную окраску водным фуксином. В результате – общий фон темный, капсулы бесцветны, сами бактерии – красные.

№6 Устройство светового микроскопа и техника иммерсионной микроскопии.